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实验七实验七 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）技术体外扩增）技术体外扩增 DNADNA 目的目的 1、学习 PCR 反应的基本原理和实验技术。 2、了解引物设计的一般要求。 原理原理 聚合酶链反应 （polymerase chain reaction， PCR） 是体外酶促合成 DNA 片段的一种技术。利用 PCR 技术可在数小时之内大量扩增目 的基因或 DNA 片段，以用于基因工程操作。 PCRPCR 进行的基本条件：进行的基本条件： ⑴DNA 模板（在 RT-PCR 中模板是 RNA） ； ⑵引物； ⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ⑷Taq DNA 聚合酶 PCRPCR 循环由三个步骤组成循环由三个步骤组成： ⑴变性 使模板 DNA 解离成单链； ⑵退火 使引物与模板 DNA 所需扩增序列结合； ⑶延伸 DNA 聚合酶利用 dNTP 合成与模板碱基序列互补的 DNA 链。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板， 通过 30 个左右循 环后，目的片段的扩增可达 106 倍。 引物设计引物设计：要保证 PCR 反应能准确，特异，有效的对引物 DNA 进 行扩增，通常引物设计要遵循以下原则： ⑴引物长度：15~25 个核苷酸； ⑵CG 含量为 40%~60%； ⑶Tm 值为 55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算； ⑷引物与非特异配对位点的配对率小于 70%； ⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于 3， ⑹两条引物间配对碱基数小于 5 个。 由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设 计。本实验以实验一中提取的质粒 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增， 大量得到目的 DNA 片段。 试剂与器材试剂与器材 一、试剂 1、 Taq DNA 聚合酶2、 10×反应缓冲液（含 25mmol MgCl2） 3、 dNTP4、 引物（P1、P2） 5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml 溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作 用，用时要小心。 6、 点样缓冲液 Loading buffer（10×） ：0.25%溴酚蓝，40%甘油。 二、器材 1、 PCR 扩增仪2、 电泳仪3、 台式离心机 4、 紫外分析仪5、 恒温水浴6、 凝胶成像系统 操作步骤操作步骤 一、PCR 扩增 1、 按下表加入试剂， 并小心混匀。 模板为实验一中提取的质粒 DNA。 试剂 体积（ 50ul） ddH2O35ul 10 x buffer5ul 10×dNTP5ul Primer P11ul Primer P21ul 模板2ul Taq 酶（2.5U）1.0ul 2、设置 PCR 程序： 94 ℃180s 94 ℃45s 35 cycles:55℃45s 72 ℃60s 72 ℃600s 3、运行 PCR 程序 二、PCR 产物鉴定 反应结束后，取 20ul PCR 产物进行 1.2%琼脂糖电泳分析。 实验八实验八 RNARNA 提取与纯化提取与纯化 一、目的一、目的 掌握 RNA 提取的基本技术，了解 RNA 提取过程中的各种注意事 项。 二、原理二、原理 RNA 提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。 RNA 提取和 DNA 提取有类似的地方， 因为它们都是核酸， 都具有较好的水溶 性。 提取 RNA 首先破碎细胞，然后用提取液将 RNA 溶出，反复 抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀 RNA，将 RNA 沉淀溶解备用。那 么如何区分 DNA 和 RNA 分开？DNA 和 RNA 的溶解性不同， DNA 在 1M 的盐溶液中具有最好的溶解度，而 RNA 在 0.14M 的 盐溶液中具有最好的溶解度， 所以可以利用它们的溶解性将它们进行 区分。另外，RNA 的分子量一般比较小，而 DNA 分子很大且和蛋 白结合成复合体，所以 DNA 更容易随蛋白沉淀，而 RNA 具有较 好的溶解性。RNA 提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境 中 RNA 酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在 180℃×6 h 以上。所有 的塑料器皿用 0.1％的 DEPC 水 37℃过夜浸泡， 然后湿热灭菌 80℃ 烘干备用。 配制溶液所需的水也要用 DEPC 处理过的水， 而配置 Tris 相关的缓冲液时 Tris 会与 DEPC 发生反应， 应避免用 DEPC 处理。 另外操作过程中应戴手套。 判断 RNA 的质量主要有两个标准， 一是 纯度，二是完整性（是否被降解）。RNA 的纯度可以通过分光光度 计进行测定的 A260／A280 值来判断。 RNA 的完整性主要通过电泳 分析来阐明，未降解的总RNA 电泳时在凝胶中会出现18S 和 28SrRNA 对应的条带（如果有 DNA 污染则在 RNA 后会发现基因 组 DNA 对应的条带） 。RNA 电泳系统也要严格对 RNA 酶进行 处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。 三、试剂与器材 （一）试剂 1、暗培养 7 天的小麦苗，用前光照诱导 3 h 2、DEPC 3、DEPC 处理的 ddH2O 4、RNA 提取液： （每 1000 毫升中含有） Tris 6.06 克 (最终浓度为 50 mM ) LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O 9.06 克) (最终浓度为 150 mM ) EDTA（0.5 M） 10 毫升 (最终浓度为 5 mM ) SDS 50 克 (最终浓度为 5 % ) 5、8 M Li Cl：33.92 克 Li Cl 溶于 100 ml DEPC 处理的 ddH2O 6、 水饱和酚 7、 氯仿 8、 0.5M NaCl 9、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml 溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用 时要小心。 10、点样缓冲液 Loading buffer（10×） ：0.25%溴酚蓝，40%甘油。 三、器材 1、 分光光度计2、 电泳仪3、 台式离心机 4、 手提式紫外监测仪5、 恒温水浴6、 凝胶成像系统 四、操作步骤 1、取植物叶片 1-3 克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些， 然后分装，小量提取试剂量可减至 1／10) 2、液氮挥发完之前，倒入含有 10 毫升 RNA 提取液的离心管中， 迅速反复倒置混匀，直至看不见任何团状物为止。 3、 立即加入 10 毫升的等体积 （酸性） 酚/氯仿， 剧烈 （！ ） 反复倒置混匀 5 至 10min（如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能 仅仅是振动！ ） 。 4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白） 。 5、重复步骤 3 和 4，三次左右（注意观察界面上白色物质） 。 6、取上清，加入等体积的氯仿，反复倒置混匀 2-5min。 7、13000g×5min。 8、取上清，加入 1/3 体积 8 M 的 LiCl （即 8 M LiCl 应占最后体 积的 25%） ， 沉淀 RNA，4℃过夜。 9、离心 13000g × 10 min。 10、 弃上清,保留沉淀 （此时应把 RNA 沉淀转入 Eppendorf 管中， 以便于操作） , 加入 70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液 0.5 毫升洗涤沉淀数分钟