神经肌肉组织活检常用方法和步骤

创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 肌肉活检样品取材和送检注意事项之樊仲川亿创肌肉活检样品取材和送检注意事项之樊仲川亿创 作作 创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 一般原则 1. 通常使用活组织切开检查法获取肌肉组织。 2. 对于具有不协调病理学功能障碍患者，切开活组织检查非常需 要，例如多发性肌炎。 3. 烧伤、缝合或磁夹部位的肌肉组织不克不及取样送检。 4. 细针穿刺肌肉组织活检可以减少病人的损伤，但也可能会取样 不全，丢失肌肉斑片或肌外膜组织。 5. 尽可能在同一活检取材位置获取数个肌肉样品，特别是对于多 病灶疾病，炎性肌病，需要做代谢分析的肌病可疑患者。 肌肉样品送检肌肉样品送检 1. 肌肉样品在湿盐水纱布中可保管几个小时，注意肌肉不该 该浸在盐水、固定剂或其他液体中，同时样品须存放于凉 爽处。 2. 样品不克不及及时送检时可用充足的干冰保管过夜。 肌肉样品冷冻与保管肌肉样品冷冻与保管 1. 样品经异戊烷予冷器处理冷冻在-160℃液氮中，也可使用丙酮 和干冰的混合液冷冻，肌肉冷冻后最好密封贮存在 -70℃，防 止酶活性和水分丢失，肌肉样品在液氮或 -70℃冰箱中可长期 保管。 2. 经上面方法处理的标本肌肉纤维形态好，光镜检查时可获得大 多数诊断信息。 3. 为了防止人为现象，送检样品冷冻处理时应该迅速 电镜样品固定电镜样品固定 1. 部分样品固定于 4%戊二醛，固定的肌肉组织多用塑料包埋剂 包埋。 2. 电镜分析可以很清楚显现肌膜毛细血管。 石蜡包埋资料石蜡包埋资料 1. 石蜡包埋的资料有利于炎症和炎细胞形态观察，但是石蜡切片肌纤维的形态较 差。 2. 福尔马林固定、石蜡包埋切片无法进行对于某些组织化学和免 疫组织化学染色，因此为了满足诊断需要，多数肌肉活检样品 创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 需要立即进行冷冻保管或新鲜标本送检。 3. 需要石蜡包埋切片的标本应用福尔马林固定。 病理实验室肌肉活检样品惯例处理方法病理实验室肌肉活检样品惯例处理方法 骨骼肌活检，应尽量防止出现人为现象。根据检查的目的进行 需要的处理。标本处理原则上要满足组织化学、电镜和生物化学 检查的要求。例如，线粒体异常需要另外保存分离线粒体的样 品。如果需要做去皮纤维（ skinned fiber 或破膜纤维）检查， 需要将标本保管在缓冲液中。 组织化学检查 活检的肌肉标本要用生理盐水浸湿的纱布包裹，放入玻璃瓶 内，纱布应该稍微挤干些，防止水分过多，水分过多容易肌肉膨 胀。样品直接流露在空气中很容易干燥。干燥的样品肯定会出现 人为现象，影响制片和诊断。操纵过程中尽量防止发生人为现 象。 一般活检的肌肉组织（直径 5mm，长度 1cm 左右），固定于软 木塞上。软木塞可选用小瓶塞（直径 1～1.5cm）将肌肉组织竖立 在软木塞上，用托辣甘树胶（黄蓍树胶）直立固定肌肉，切片时 使呈横断面。注意不要将肌肉完全包埋在黄蓍树胶中。 肌肉组织需要骤冷冷冻，否则会发生冰晶。肌肉组织的细胞比 较大，特别容易发生冰晶。含有冰晶的肌肉组织染色后细胞内会 出现大小不等的空泡。为了快速冷冻，一般使用液氮（- 160℃），丙酮、干冰混合液（ -90℃）。如果将组织直接放入液 氮内组织周围发生大量的汽化液泡，发生热隔断效应，会延迟冷 冻速度。所以现在的方法是先将发生气泡较少的异戊烷冷却于液 氮中，再将组织放在充分冷却的异戊烷中进行冻结。 100ml 烧杯在颈部系上牵绳，往烧杯中加 60～70ml 异戊烷，将 烧杯轻轻放入液氮中。为了使异戊烷冷却均匀，用搅拌棒或镊子 不竭搅拌异戊烷，开始时液氮因激烈汽化而冒出白烟，而后逐渐 减少。异戊烷充分冷却后，在烧杯中发生白色结晶。 用大镊子夹住软木塞，迅速置入异戊烷中，迅速左右轻柔地晃 动。托辣甘树胶粘附固定肌肉目的就是在充分冷却的异戊烷中轻 柔细微地晃动。如果将组织静置在异戊烷中，组织周围异戊烷的 温度升高，包裹在组织周围，不克不及迅速完全冻结，组织容易 形成冰晶，组织轻微晃动冷冻液充分流动，使组织迅速冻结，很 难形成冰晶。在异戊烷中冷冻20-30 秒钟。移入放有干冰的箱 中，放置 1 小时，使组织周围的异戊烷挥发干净。放入能密封的 塑料袋或玻璃瓶中防止组织干燥，置 -70℃冰箱中保管。-70℃以 创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 下密封保管最少可保管 1 年，不会影响组织化学检查结果。我们 观察保管 10 年以上的标本，染色后的效果和新鲜组织没有明显不 同。 恒温冷冻切片冷冻切片机内部的温度 -25～-20℃为宜。低于 - 25℃时，肌肉过硬，容易出现横皱，高于-20℃时含脂肪、结缔组 织的肌肉伸展不良。容易出现皱褶现象。最好在载玻片粘贴 2～3 行连续切片的组织。 冰冻切片室温保管 2～3 天进行任何染色都不会使活性降低， 但室温保管 5 天以上，ATPase 染色或 Phosphoryase(磷酸化酶)染 色效果较差。另外，改良 Gomori 染色法最好在切片当天进行。 肌肉组织活检冷冻步调肌肉组织活检冷冻步调 用品用品 1. 液氮 2. 异戊烷 Isopentane (2 methyl butane) 3. 长把手镊子 4. 两个金属容器 5. 手套 6. 一次性软木塞 平安与防护平安与防护 注意：异戊烷非常易燃，不要让该资料到达室温，放入液氮时使 用防护眼镜。 试剂配制试剂配制 7%托辣甘树胶（Gum Tragacanth） 托辣甘树胶7g 蒸馏水100ml 麝香草酚5 粒 托辣甘树胶加入蒸馏水中溶解，再加入 5 粒麝香草酚，室温搅 拌。 注：托辣甘树胶非常难溶解，溶液可放在室温间断搅拌。配制 后 4℃保管，保质期 6 个月。(口香糖的主要成分为托辣甘树胶， 口香糖用开水或温水浸泡 5min，然后再用蒸馏水几次，用清洗后 的口香糖代替托辣甘树胶使用，用于粘附固定组织效果其实不受 影响。口香糖的使用方法仅自己试用，主要顾虑是否会影响PAS 染色，口香糖的使用需要更多的实践检验)。 肌肉冷冻步调肌肉冷冻步调 1．放适当量的托辣甘树胶于软木塞上，将病人姓名和病理编号写 到软木塞或贮存肌肉样品的容器上。 创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 2．将肌肉组织放在托辣甘树胶中（肌肉组织需要流露 1/3 或 1/2 托辣甘树胶之上，不要完全埋到托辣甘树胶中）。肌肉埋入的 方向垂直，肌丝横断面向上（切片为横断面）。 3．准备一个 100ml 小烧杯装入 60～70ml 异戊烷，用规格为 700mm 的滤纸包住小烧杯的口，再用橡皮筋扎住小烧杯周边的滤纸小 心放入液氮中，不要将异戊烷浸到液氮中，让异戊烷降到- 140℃，异戊烷下面冻成固体上面呈液态时即可开始冷冻。 4．用长镊子夹住软木塞将准备好的肌肉组织朝下浸到异戊烷中迅 速冷冻，并在异戊烷中轻轻地晃动10 秒左右，加快冷冻速 度，防止形成冰晶。 5．用镊子夹住软木塞不动维持 20 秒钟，（较小于 0.3cm 的组织 5 秒钟）冷冻过程中不要将肌肉组织离开异戊烷，直到组织冷冻 完成。 6．小心将冷冻的组织包埋块拿出来，迅速放入预冷的容器中密封 贮存或及时做冰冻切