流式检测细胞周期要点

1. 收集细胞； ～5000rpm 离心 5min，收集沉淀，重悬于 200ul 的 PBS 中，再次离心收集沉淀； ％冰冻乙醇（-20 度保存）4 度固定过夜 or-20 度固定 1h； 4.离心收集沉淀，PBS 洗一次（视沉淀量可忽略） ； 5.沉淀重悬于 200～500ul 的 PBS，加入 Rnase A 37 度水浴 1h； 目纱布过滤至流式管，加入PI 染色，4 度避光 30min-1h，上机器。 1、Q：要做胃粘膜组织的 DNA 含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请 问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？ A：我做过乳腺细胞的 DNA 含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加 70%冰乙醇固 定，要保证冰乙醇的最终浓度为 50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存 12 小时，最多可保存一个月，上 机检测前再加 PI 综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为 5%. 2、实验中想用 PI 分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题： Q：（1）所用的 RNAs 酶用什么配制呢？用 PBS 配吗？ A：RNaseA 用 PBS 配制没有问题，但是注意要沸水浴去除 DNase 的活性。 Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用 RNAs 酶，可以一起检测吗？ A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。 Q：（3）Triton－x－100 是固定剂吧，用了 70％的冷乙醇（是 4℃吗？），是不是就不用 Triton－ x－100 固定了？ A：Triton X-100 是起透化作用的，不是固定剂，可以用 75％的乙醇于-20 度固定。 Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？ A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。 Q：（5）不用试剂盒行不行啊？ A：完全可以不用试剂盒。 以下提供一个自己的实验步骤供参考： （1）200×g 离心 10min 收集细胞； （2）弃去上清，PBS 漂洗一次，将细胞重悬于预冷的 80%乙醇中，-20°C 固定 24h 以上； （3）进行流式细胞仪检测前，200×g 离心 10min 收集固定后的细胞； （4）PBS 洗涤一次，200×g 离心 10min 收集细胞； （5）将细胞重悬于含 100ug/ml RNase A 和 50ug/ml PI 的 PBS 中，室温孵育 30min； （6）将经 PI 染色和 RNase A 消化后的细胞悬液用 300 目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行 细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。 3、Q：流式检测细胞周期时加 RNA 酶所需的温度？ A：其实有关 RNA 酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为 R NA 酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的 RNA 酶已足以降解样品中的 RNA，所以 为了简便实验操作，也有人不加 RNA 酶或如你所参考的方法将其与 PI 染液一起使用。不过经典的方法还是 “先加 RNA 酶 37 度孵育 30min，然后加 PI 4 度孵育 30min”。 至于染色时使用 4 度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光 损耗。上流式前细胞用 75％乙醇固定行吗？ 4、Q：我养肿瘤细胞，测周期。看到帖子说 70％乙醇必须用 PBS 和乙醇配，用水配细胞会碎裂，有 帖子说 PBS 和乙醇配会出现絮状物。上流式前细胞用 75％乙醇固定，就用买来的现成的瓶装 75％乙醇，行 吗？必须那么严格吗？ A：先用冷 PBS 悬浮细胞，大约 1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙 醇，终浓度为 70-75%乙醇。不直接加 75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬 成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。 5、Q：我要做流式分析细胞周期，我大概收集了 10 的 6 次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到 有细胞沉淀的，但 PBS 洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现就发现不了细胞了。这是怎么 回事啊？怎么解决这个问题啊？ A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有： （1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机 （2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留 1mm 左右的水膜，不要吸完。 （3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿 （4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分 细胞。 6、Q：流式细胞 PI 单染中为什么用 RNAse？ A：在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI 很容易透过细胞膜和 DNA 结合，但 RNA 也是核酸， 也会被染色，为避免干扰染色前需用 RNAse 降解 RNA。这样 PI 只染 DNA，能精确以荧光强度反映 DNA 的含 量。 7、最近做了几次流式细胞仪检测细胞周期，发现有几个问题： Q：（1）我所用的是肿瘤细胞， 但是同样的细胞类型，同样的处理因素，虽然两次独立实验作出来 的结果总体趋势都是在某种药物干预后，S 期比例下降，但两次结果 S 期比列具体数值相差很大，同样，G 2/M 期在干预前后无变化，但两次独立实验数值却相差很大，那么可以说，做流式是每次细胞状态不一样， 结果也会相差很大，是不是细胞密度会对结果产生很大影响，那么如果细胞密度在60-70%时和细胞已经长 满（90%以上）也会导致各期数值的差异？如果是这样，长满的细胞（不再增殖）是表现的G1 或 S 或 G2/M 上升还是下降？ A：应该是两批细胞在实验时本身所出周期不同所致，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批 间差异。实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。自然状态下，不增殖 的细胞应该处于 G0/G1 期。 Q：（2）其次就是结果分析，细胞周期特异性药物如抗代谢药作用后主要表现的是 S 期比例下降， 细胞被阻滞在 G1 期，自然 G1 期比列升高。而有些植物药如长春碱类或紫杉醇类，主要作用于 M 期，那么 结果是否表现为 G2 期比例升高， 还是 S 期也相应升高？还有就是细胞经抗肿瘤药物作用后反而出现的 S 期 升高，可能是那些原因，如何分析？ A：周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其它阶段细胞增多。 8、Q：我用流式做胃癌细胞周期分析时不出现 S、G2/M 峰？什么原因呢？自己分析可能为 PI 没染上 色，是不是染色时间太短呢？ A：你用了多少 PI 染色多久呢？一般来说 30 分钟够了.我觉得可能是打孔或者 rna 没有处理掉没有 成功，染色时间并不是关键。 9、Q：做流式细胞时，PI 染色，PI 的浓度应该是多少?还有就是 400 目的筛网是什么？不用可以吗？ 谢谢。 A：100ug/ml，一般用 400 目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干 扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果经验丰富也可以gate 掉的。如果你没有条件，建议在染色 之前将细胞弹的很散，再进行染色 10、Q：流式细胞仪观察细胞周期