基因工程与食品产业

第二章基因工程与食品产业 1.基因研究的发展过程 1.1 基因学说的创立 1.2 基因与 DNA 分子 2. 基因工程的概念及主要内容 2.1 基因工程的概念 基因工程也就是 DNA 重组技术，是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离 出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成重组体，然后再把重组体引入宿主细胞中得以高 效表达，最终获得人们所需要的基因产物。 2.2 基因工程的主要内容 概括起来，基因工程的操作过程一般分4 个步骤，如图，第一步，获得目的基因并制备 载体（质粒、病毒或噬菌体） ；第二步，把获得的目的基因与制备好的载体用 DNA 连接酶 连接组成重组体；第三步，把重组体引入宿主细胞；第四步，筛选、鉴定出含有外源目的基 因的菌体或个体。 3. 工具酶和基因载体 3.1 基因工程的工具酶 （1）限制性内切酶 限制性内切酶的定义：是一类能识别双链DNA 中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条 件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开， 产生具有 3„-OH 基团和 5‟-P 基团的 DNA 片段 的内切脱氧核糖核酸酶。 至今发现的限制性内切酶有三种类型，各具特性，基因工程操作中真正有用的是 II 型 酶。 II 型限制性内切酶的命名 命名原则一般是以酶源生物的属名和种名前1、2 个字母以及株(型)代号来命名。如果从 同一种生物中先后分离到多种限制性内切酶，则依次用罗马数字表示。 举例： EcoRI 中的 Eco 表示从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出来的， R 代表大肠杆菌 的 R 株，I 表示从中分离出的第一种限制性内切酶。 从流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)菌株 d 中分离出来的第三种限制酶，被命名为 HindIII。 II 型限制性内切酶的识别序列：限制性内切酶在双链 DNA 上能够识别的核苷酸序列被 称为识别序列。 多数限制酶的识别序列由6 个核苷酸对组成。 少数限制酶的识别序列由4 个或 5 个核苷 酸对组成，或者由多于 6 个核苷酸对组成。 限制性内切酶识别序列的共同规律：呈回文结构，即序列被正读和反读是一样的。 II 型限制性内切酶的酶切位点：DNA 在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷 酸二酯键断开的位置被称为酶切位点，可用￬表示。限制酶在 DNA 上的酶切位点一般是在 识别序列内部，如 G ￬GATCC、AT ￬CGAT 等。少数在两侧，如￬GATC、 CATG￬等。 (2)DNA 连接酶 DNA 连接酶：能将两段 DNA 拼接起来的酶称为 DNA 连接酶。该酶催化 DNA 相邻的 5„磷酸基团和 3‟羟基末端之间形成磷酸二酯键，将DNA 单链缺口封合起来。 DNA 连接酶只能封闭双螺旋DNA 骨架上的缺口，而不能封闭裂口。 粘性末端 DNA 片段的连接：具粘性末端的 DNA 片段的连接比较容易，也比较常用。 1 但是，在连接反应混合物中，具有粘性末端的载体DNA 分子会发生自我环化作用，并在连 接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构。 这样， 就会使只含有载体分子的转化子 克隆的“本底”比例大幅上升，最终给重组DNA 分子的筛选工作带来麻烦。用碱性磷酸酶预 先处理线性的载体 DNA 分子，以移去其末端的5‟磷酸基团，可以克服这一缺点。 平末端 DNA 片段的连接： 1)同聚物加尾法：利用互补的同聚物序列之间的退火作用完成的连接。其核心部分是， 利用末端脱氧核苷酸转移酶（能够在无模板链的情况下，将核苷酸加到DNA 分子单链延伸 末端的 3„-OH 基团上）转移核苷酸的特殊功能。 2)接头连接法：DNA 接头，是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头 为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 (3)DNA 聚合酶 DNA 聚合酶：具有催化DNA 体外合成反应作用的酶称为DNA 聚合酶。这类酶的特点 在于，能够把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA 分子引物链的 3‟-OH 末端，催化核苷酸的聚 合作用。DNA 聚合酶作用时大多都需要模板，合成产物的序列与模板互补。 3.2 基因工程载体 理想的基因工程载体应具备的特征： (1) 具有复制起点，能携带外源DNA 片段进入受体细胞，进行稳定的DNA 自我/同步复制 (2) 具有标记基因 (3) 具有若干限制酶的单一识别位点 (4) 具有较高的外源 DNA 的载装能力 3.2.1 质粒载体 3.2.1.1 质粒的一般生物学特性 环形双链的质粒 DNA 分具有三种不同的构型：共价闭合环形DNA；开环 DNA；线形 DNA。 质粒 DNA 的复制类型：根据寄主细胞所含拷贝数的多少，可将质粒分成两个不同的复 制型：一种是低拷贝数的质粒（ 1-3 份拷贝） ，称为“严密型”复制控制的质粒；另一种是高拷 贝数的质粒（10-60 份拷贝)，称为“松弛型”复制控制的质粒。 拷贝数的常用定义：生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒 DNA 分子的数目。 一种质粒究竟是属于严密型还是松弛型并非绝对的，还受到寄主的控制。例如，R1 质 粒 大肠杆菌寄主（严密型） 、奇异变型杆菌寄主（松弛型） 。 3.2.1.2 质粒载体的构建及重要的质粒载体 为改进转化子筛选技术， 有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的选择记号， 又具有低分子量、高拷贝等优点的新的质粒载体。如pBR322 质粒载体 3.2.2 噬菌体类载体 若要构建一个基因文库，往往需要克隆更大一些的DNA 片段。为满足这一要求，人们 把噬菌体发展成为一种克隆载体。 噬菌体高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 自主复制繁殖性能使外源基因 在受体细胞中高效扩增，因而噬菌体能被开发成基因工程的有用载体。  噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。 其基因组中有部分基因为非必要基因， 被外源 基因取代后，并不影响其生命功能。这是赖以发展作为基因克隆载体的一种重要特性。  噬菌体载体的主要类型： 噬菌体包装的上下限： 50.5-37kb。构建  噬菌体载体的基本 原理是多余限制位点的删除和切除掉非必要的区段。 构建出的派生载体， 可归纳成两种类型： 2 一种只具有一个可供外源DNA 插入的克隆位点，称为插入型载体；另一种具有成对的克隆 位点，在这两个位点之间的DNA 区段可被外源插入的 DNA 片段所取代，称为取代型载体。 柯斯质粒载体：是一类由人工构建的含有 DNA 的 cos 序列和质粒复制子的质粒载体。 柯斯质粒载体的特点：具有λ噬菌体高效转导的特性、具有质粒载体自我复制的特性、 具有高容量的克隆能力。 四、基因工程的基本技术 4.1 目的基因的获得 目的基因：在基因工程设计和操作中， 被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期 表达产物的基因。 获得目的基因的途径 获得目的基因有多种方法， 目前采用的方法主要有限制性内切酶酶切直接分离法、 PCR 扩增法和化学合成法、cDNA 基因克隆等。 cDNA 基因文库构建步骤： 第一步：分离细胞总 RNA，然后从中纯化出主要含mRNA 的分部； 第二步：合成第一链 cDNA； 第三步：将 mRNA-DNA 杂交分子转变为双链 cDNA 分子； 第四步：将合成的双链