基因工程期末复习总结

一、单选 1、第一个实现 DNA 重组的实验 :1972 年， 美国斯坦福大学医学中心 的 P.Berg 在世界上第一次成功地实现了 DNA 的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验 ：1973 年，科恩（Coher）和 博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA 在生物体内的存在状态：染色体 DNA、病毒 DNA（噬菌体 DNA）、质粒 DNA、线粒体 DNA 和叶绿体 DNA，有的以线型存在， 有的以环状存在。 6、天然 DNA 提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提 DNA。 7、DNA 的分离抽提法：酚-氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA 的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降 解。 9、为了消除在制备 RNA 过程中 RNA 酶的污染， 应用 0.1% DEPC 处理 过的水配制试剂。 10、人工合成 DNA 片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增 法。 11、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用）， 纯净的核酸溶液 的 0D260/OD280值应为1.7~2.0，0D260/OD230值应 大于 2.0，如果 0D260/OD280小于 1.7，可能有蛋白质污染，如果 0D260/OD280大于 2.0 或 0D260/OD230小于 2.0 时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。 12、工具酶就其用途而言可分为三大类： 限制性内切酶、连接酶和修 饰酶。 13、 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言， 限制性核酸内 切酶的命名：属名 +种名。例如： Bacillus amylolique faciens H、 Haemophilus influenzaed Ⅰ→ Bam H、HindⅠ。“属种株序 ” 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制—修饰系统。 16、限制性内切核酸酶的作用机制：识别双链DNA中特定的核苷酸 序列 （识别序列） ， 并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开。 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。 18、承载外源 DNA 的大小排序：质粒（20kb）噬菌体（20-30kb） cosmid 载体（40-50kb）人工染色体载体（100-1000kb）。 19、受体细胞的种类:1）原核生物细胞例：大肠杆菌；枯草芽孢杆 菌；蓝细菌；2）真核生物细胞包含 酵母细胞、植物细胞、动物细 胞。 19、常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放射性两大类， 非放射性探针包括生物素标记探针、地高辛标记探针、荧光素标记探 针。 20、 根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的 不同， 核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、 斑点印迹杂交、 Southern 印迹杂交（DNA）和 Nothern 印迹杂交（RNA）四类。 （PS:如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、 组织提取的总 DNA 或 RNA 样品中是否含有目的基因，则可采用斑点 印迹杂交(dot blotting)或狭线印迹杂交(slot blotting)进行检测。 菌落（或噬菌斑）原位杂交是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到用于杂 交的膜上，经溶菌和变性处理后使 DNA 暴露出来并与滤膜原位结合， 再用 DNA 探针与其杂交。） 21、重组子筛选的方法： 1）遗传表型直接筛选 2）依赖于重组子结 构特征分析筛选 3）核酸分子杂交分析4）免疫化学分析检测5）PCR 筛选法。 22、重组基因导入受体细胞的方法：Ca2+（诱导大肠杆菌）转化法、 电激穿孔、基因枪法、显微注射法、病毒转染法 二、名词解释 1、多克隆位点（MCS）：是包含多个（最多20 个）限制性酶切位点 的一段人工 DNA 序列。 2、衔接头：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切 酶识别序列。 其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末 端。 3、限制性内切核酸酶：识别双链DNA 中特定的核苷酸序列（识别序 列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的一类酶，简 称限制酶。 4、回文序列：DNA 片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制 性酶切位点。 5、同裂酶：识别相同序列的限制性内切酶称为同裂酶。它们的切割 位点可能不同 6、同尾酶：切割不同的DNA 片段，但产生相同的粘性末端的一类限 制性内切酶。 7、星性活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似 的序列，又称 Star 活性。 8、克隆载体：一种能携带外源DNA 片段进入受体细胞，并在受体细 胞中得以维持或表达的 DNA 分子。 9、（质粒的）不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系 密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 10、显性质粒（表达型质粒）：指携带除与自身复制和转移相关的基 因，还携带一些使宿主细胞呈现新性状基因的质粒。 11、隐蔽质粒：不能使宿主细胞呈现新性状的质粒。 12、基因组文库：指贮存了某种生物全部基因信息的一个受体菌群 体。 13、cDNA 基因文库：某种生物材料的基因转录产物 mRNA 经反转录 形成不同的 cDNA 片段，与克隆载体重组后贮存在受体菌群体中，这 样的群体称为 cDNA 基因文库。 14、受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从实验技术上讲，是 能摄取外源 DNA 并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲，是有应 用价值和理论研究价值的细胞。 15、感受态细胞：指处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态的 细胞。 16、分子探针： 指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对 其相互作用的产物进行有效检测的 DNA 分子、RNA 分子和蛋白质分 子。 三、简答题 1、简述聚合酶链式反应的基本原理、步骤和所需物质（反应物）。 原理：模仿细胞内发生的 DNA 半保留复制过程，在体外由酶催化合 成特异性 DNA 片段。 步骤：1）变性:目的双链 DNA 片段在 94℃下解链; 2）退火:两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板 上的目的序列通过氢键配对; 3）延伸: DNA 模板—引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下， 以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理， 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环 变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。 物质：DNA Taq聚合酶、Buffer 、MgCl2 、dNTP 、上下游引物、模 板 DNA、ddH2O。 2、简述琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别。 琼脂糖凝胶的凝胶孔径大,适合大分子 DNA 电泳和需要快速简单 分析的 DNA 电泳,电泳方式一般采用水平潜水电泳.优点是快速简单, 但分辨率不是很高,对于差异较小的 DNA 片段难以分辨. 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于 1Kb 的 DNA 片段和 DNA 序列分析.其装载的样品量大,灵敏度高 分离鉴定6bp~1kb个核苷酸的核酸片段用聚丙烯酰胺