从组织器官分离细胞

从组织器官分离细胞从组织器官分离细胞 一、非酶分离细胞方法 (一)机械分离法适用于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、 胸腺、胚胎组织、肿瘤组织等。 1.组织研磨法： 操作方法： (1)取消毒的碟皿(直径 5～8cm 或略大)，放入少许 Hanks 液或 PBS; (2)将采取的小块组织先用 PBS 漂洗去组织表面的血污，剪成撕 去附带的其它组织，如脂肪或多余的纤维、包膜等，切成 5mm3 左右 大小的小块，放入碟皿内 Hanks 液或 PBS 中; (3)用锋利手术刀或眼科剪将组织剪切成 1mm3 左右的碎组织块; (4)将碎组织及 Hanks 液或 PBS 置于较松的组织研磨匀浆器内， 用手缓慢研磨(可反复几次)，形成散在细胞的匀浆。 (5)将组织匀浆经 40 目或 100 目不锈钢网过滤去除纤维组织、血 管及较大的凝块。过滤时可用 Hanks 液或 PBS 冲洗; (6)将过滤的细胞匀浆悬液直立静置片刻使较大的组织块及红细 胞先沉淀，取上部细胞悬液，以 Hanks 液或 PBS 洗涤，离心，收集 细胞; (7)计算活细胞率，计数细胞，制备成所需浓度的细胞悬液。 注意：组织研磨匀浆器不能太紧，研磨时应缓慢，否则易使细胞 损伤、破碎、或增高死亡细胞率。 2.不锈钢网挤压法： 操作方法： (1)将切取的组织块以 PBS 漂洗去表面血污，切成 5～10mm3 的 组织块; (2)在消毒碟皿内放少许 Hanks 液或 PBS，把 40 目～100 目的不 锈钢网放入 Hanks 液或 PBS 中，将组织块置网上，用消毒注射器芯 或试管的底端轻轻压挤组织，使其穿过网眼入Hanks 液或 PBS 中。 同时，用 Hanks 液或 PBS 冲洗网上的组织。最后，将网上剩余的纤 维包膜或血管等弃去; (3)收集 Hanks 液或 PBS 液中的细胞悬液显微镜检查，如仍有较 多的小组织块，可用更细的不锈钢网(20μm)重复压挤 1 次; (4)收集 Hanks 液或 PBS 细胞悬液。 1000r/min 离心片刻使残留较 大组织碎块及红细胞沉淀， 吸取未沉淀的细胞悬液。 再以 Hanks 液或 PBS 洗涤，离心，收集 1 次; (5)计数活细胞率及计算细胞数，制备所需浓度的细胞悬液。 注意：如经 1 次压挤尚有较多的碎组织块，也可用消毒注射器， 带 6 号注射针头，将细胞及碎组织从注射器内经针头压出， 使细胞再 次分散。 3.吹打分离法：此法只适用于很松软的组织，如从脑组织分离胶 质细胞。 操作方法： (1)取小块脑组织，剥离脑膜，血管等纤维组织后，用Hanks 液 漂洗 2 次; (2)在消毒碟皿中放约 2～3 倍于脑组织的 Hanks 液，将脑组织置 Hanks 液中，用滴管吸取 Hanks 液反复吹打脑组织使成悬液; (3)将组织悬液经 40 目尼龙网过滤后，移入试管中直立静放 5～ 10 分钟，较大的组织碎块及红细胞下沉，脂肪及碎细胞片等漂浮在 液体上部。吸取中间部分的细胞悬液，并如此反复2～3 次; (4)取少许细胞悬液显微镜检查，如已制成较多的散在细胞悬液， 可计数活细胞率。 计数细胞用 Hanks 液或适当的培养液制备成所需浓 度的细胞悬液。 (二)EDTA 分离法EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid)，是一 种螯合剂(chelatingagent)，能与组织内的 Ca2+、Mg2+离子螯合而使 细胞分离。 EDTA 常用 PBS 等配成 0.02%的工作液。其作用温和，在一般情 况下对细胞损伤较小，但分离效果并不很高。可用于分离一些胚胎组 织或肝脏灌流，不过较少单独使用，常和其它一些酶(如 0.25%胰蛋 白酶)混合使用(以 1∶1 或 2∶1 混合);但不要与胶原酶混合使用，因 这种酶依赖 Ca2+和 Mg2+，与 EDTA 混合后可使胶原酶的消化作用 严重障碍或失效。与胰蛋白酶混合可用于分离培养细胞进行传代培 养。 其方法是将培养细胞的培养液吸去后， 加入 0.02%EDTA 与 0.25% 胰蛋白酶的混合液，以盖满细胞为度，处理3～10 分钟，注意不能消 化过度使细胞收缩脱落。吸出消化液，立即用Hanks 液洗涤 2～3 次 以洗去 EDTA。最后加入培养液，用滴管吹打使细胞脱落形成细胞悬 液。 使用 EDTA 应注意分离时间不能过长。因其对细胞的线粒体可 有损伤，而且细胞长时间处于无 Ca2+环境下(被 EDTA 螯合)则可使 细胞内 K+降低;同时呼吸减弱也可造成细胞损害。 (三)其他非酶分离细胞方法甘氨酸(glycine)也可用于分离细 胞，如用含 1mol/L 甘氨酸与 2mol/LEDTA 的混合液分离海胆胚胎。 双糖(disaccharides)，如高张蔗糖、乳糖、麦芽糖等(常用 0.5mol/L)可 分离细胞间的缝隙连接或紧密连接等。0.5%KOH 的稀碱溶液(pH9.3 左右)也可用于胚胎组织的分离。 但如将 pH 恢复正常， 则分散的细胞 又可再聚合。 二、酶分离细胞技术 可用于分离细胞的酶很多。蛋白水解酶类有胰蛋白酶(trypsin)、 胶原酶(collagenases)、弹性蛋白酶(elastase)、链霉蛋白酶(pronase)、 溶菌酶(lysozyme)、木瓜蛋白酶(papain)等。其它酶类有透明质酸酶 (hyaluronidase)，脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease)等。这些酶各有 优缺点，对细胞的损伤也各不相同， 所以对使用何种酶应按实验要求 加以选择。比较常用的有胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸 酶等。 胰蛋白酶适于消化间质较少的组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、 肝、肾等;对纤维性组织的消化能力较差。Ca2+、Mg2+对其活性有抑 制作用，故配制时应不含 Ca2+或 Mg2+，或与 EDTA 配伍使用。胰 蛋白酶的工作浓度为 0.01%～0.5%，常配成0.25%的工作液。室温及 37℃下消化比较恰当， 4℃时仍有缓慢的消化作用。 最适工作pH为8～ 9 左右。消化时间最短(如胚胎组织)为 20～30 分钟，一般为 30～60 分钟，低温或低浓度时也可延长至 12～18 小时(过夜)。 胶原酶适用于消化分离纤维组织，对上皮、肝、胰、肾及一些癌 组织的细胞分离也比较适用。它有很多类型，Sigma 厂的产品有 1～ Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅺ等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞或一 般纤维组织，应按实验要求，按产品说明书选用。胶原酶与胰蛋白酶 不同，它必须在 Ca2+及 Mg2+存在的条件下，才能较好地活化。常用 的浓度为 100～200U/ml(按说明书配制。一般产品125U/mg，故 工作浓度常用 0.05%～0.1%，高纯度胶原酶可为1200U/mg 或 1000～3000U/mg)。该酶的作用缓慢，常需较长的消化时间。 链霉蛋白酶为非特异性具有广谱性质的中性蛋白酶， 适于分离消 化道的粘膜上皮细胞及肝脏的 Kupffer 细胞。其消化速度比胰蛋白酶 快。分离的消化道上皮存活率可高达 96%左右，较其它酶优越。 透明质酸酶对间质中含多量透明质酸的组织比较适用，对热稳 定，工作 pH 较宽，