综述：无缝克隆与基因融合中文版

无缝克隆与基因融合 基因融合技术是基因功能研究的关键工具。 准确拼接的杂合分子， 没有任何无关的序列， 使 我们可以对分子进行精确的研究。 本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用， 以及获得这 些杂交分子的方法 前言 随着各种基因组测序项目的完成， 人们越来越关注基因产物的功能分析。 基因融合技术在基 因功能研究的许多方面具有重要的作用， 包括基因和蛋白标记， 报告基因的研究，结构域互 换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消 化和 DNA 连接反应（所谓的剪切/粘贴反应） ，曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。然 而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。这些多余的序列可以改变 DNA 元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不 需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处， 概括了实现无缝基因融合的方法。 无缝基因融合及其应用无缝基因融合及其应用 无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA 片段精确结合在一起，在 DNA 片段的接合处 没有任何不需要的序列。 这是获得杂交基因的理想情况。 以下强调几个例子，以表明无缝基 因融合的重要性。 启动子和外显子研究 基因启动子含有许多调控元件。 转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。 启动子删除分 析使我们鉴定到这些功能元件， 获得关于基因调控机制的重要信息。 然而，因为不同调控元 件之间的间隔常常是非常重要的， 通常需要长度不变的 linker来维持这些元件的间隔和螺旋 面。基因启动子的 linker 扫描分析需要无缝 DNA 融合或者序列替换技术。分子演化方法例 如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝 拼接。在真核细胞中，通过内含子介导的RNA 拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。在这些 实验中 RNA 底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。只要 杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。 蛋白质功能研究和蛋白质工程蛋白质功能研究和蛋白质工程 蛋白质由有功能结构域构成。 为了阐述一个蛋白某个结构域的功能， 需要构建该结构域删除 或者被相似结构域替换的突变体。 这种结构域删除或者互换实验将在很大程度上得益于相关 元件的无缝融合，来消除有操作序列所带来的潜在的负面影响。 更加概括地说，不同结构域 的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的， 包括获得新的杂交分子和抗体改造。 对于抗体改 造，互补决定区嫁接（CDR-grafting）和定点突变是经常要做的。嵌合体蛋白也可以通过內 含肽介导的蛋白拼接和连接获得。 只要含有內含肽的前体蛋白没有多余的序列， 精确蛋白融 合就可以实现。 蛋白质表达蛋白质表达 标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达。 它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来 的目的蛋白的亲和纯化。 在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下， 整个融 合蛋白可以直接用到接下来的研究中。对于酶学研究和测定， 通常是这种情况。然而， 在许 多情况下，移除融合蛋白是必要的， 这可以通过改造的蛋白酶酶切位点来完成。 这个过程需 要蛋白酶切位点和目的蛋白之间无缝的连接。 为了进行功能研究， 在一些情况下携带一个短 标签（比如 his 标签）的融合蛋白被成功地结晶，移除这个标签是不必要的。然而，如果带 有标签的蛋白无法结晶，就难以估量标签的影响，标签的切除通常是必要的。 在表达成熟和有活性蛋白的过程中，常常需要表达蛋白氨基酸序列与原来的一样。例如 RANTES（调控激活，正常的T 表达和分泌）蛋白，interleukin18 （IL18 ） ，IL1 β和 hirudin 蛋白的表达。在这些蛋白的 N 端加上甲硫氨酸残基严重地降低了这些蛋白的活性。对于 RANTES，Met-RANTES 被发现是天然 RANTES 的拮抗剂。如果要在大肠杆菌中表达完整N 端蛋 白，一个实用的方法就是将蛋白与N 端标签融合表达并纯化。纯化和重折叠（如果需要）之 后， 通过专一改造的蛋白酶酶切位点将标签和不需要的序列切除。 这个过程需要蛋白酶切位 点和目的蛋白之间的无缝拼接。 肠激酶，Xa 因子和泛素特异性蛋白酶 （Ubps）是常用的酶， 这些酶可以切开识别序列的C 端。 烟草蚀刻病毒蛋白酶对于酶切位点下游的氨基酸残基要求 比较宽松，也可以用来去除融合标签。 ubiquitin/Ubp 可能是第一个用来在体内和体外获得 完整 N 端蛋白蛋白的系统。在大肠杆菌中表达成熟的人类Apo A-I 蛋白，Mogilevsky 和同 事发现泛素标签系统是最直接的方法之一。 基因组操纵基因组操纵 在模式生物中目的基因的敲除和敲入技术是体内分析基因功能的有力工具。 这个过程常常包 括整个开放阅读框或者一部分编码特殊结构结构域的基因的删除， 在一些情况下利用一个等 位基因突变体或者同源基因序列的替换。 这些研究需要产生敲出和敲入的载体， 在其中所有 的功能元件包括侧翼序列， 需要同源重组精确地连接到一起。 无缝基因融合技术将会显著地 促进载体构建。Link 及其同事利用重叠 PCR 技术获得基因精确删除的载体，用以在大肠杆 菌基因组中进行功能研究。 为了进行动物病毒繁荣分子和病理学研究和疫苗载体开发， 经常需要合成整个病毒基因组或 者改造杂交病毒载体。利用无缝基因融合技术看，Tount 和同事用 PCR 片段成功地拼接了 31.5Kb 的重组病毒基因。 无缝基因融合技术无缝基因融合技术 在 PCR 技术发明之前，DNA 片段的无缝融合是通过复杂的程序完成的，涉及到利用细菌的基 于噬菌体 M113 的定点突变， 多核苷酸引物， linker 和核酸外切酶， 质粒在大肠杆菌中扩增。 在一些情况下需要利用 RecA 依赖的同源重组。这些过程需要仔细的设计载体，需要复杂的 程序。由于传统方法的局限， 仅仅有几例利用这些方法进行无缝基因融合。 一个例子就是利 用一组突变载体进行基因启动子的link 扫描分析，另一个就是酵母中蛋白稳定性分析。 随着 PCR 技术的出现， 无缝基因融合有了很大的发展。 已经发展了几种无缝基因融合的方法， 许多其他方法经过修饰也可以用于此目的。这些方法将在下面讨论并列举在表1 中。PCR 常 常是用来进行精确的 DNA 操控或者修饰 DNA 元件的末端用来进行合适的基因融合。 利用这些 创新的方法，我们操控 DNA 序列的水平达到了一个前所未有的水平。例如，在研究 P1’氨 基酸残基对肠激酶酶切融合蛋白的影响中， 通过一种 PCR 和连接不依赖克隆的无缝基因融合 技术构建了 20 个 GST–EK–X–calmodulin 融合基因 （其中 X 代表 20 个氨基酸的一种， GST 是谷胱甘肽-S 转移酶） 。 重叠重叠 PCRPCR 在 PCR 技术发明之后就出现了重叠PCR 技术。 重叠 PCr 是一种非常有效的过程， 不依赖与任 和限制性酶切位点， 在片段都可以扩增的前体下， 任何两个片段都可以在任何确定的位点自 由地结合到一起。利用相同的原则，多个 DNA