细菌总数

化妆品微生物细菌检测方法化妆品微生物细菌检测方法 文件编号：MKF-2-JZ-012 版本：A/0 生效日期：2014/12/20 1.1. 目的目的 将一定量的水溶性样品和水不溶性样品溶解于适当的灭菌溶液中，按定比例 进行稀释，取稀释液定量于培养基中，将平皿在适当条件下培养、计数。 2.2. 范围范围 本规范适用于公司所有样品的微生物细菌检测，包括原料、半成品、包材和 成品。 3.3. 定义定义 3.1 菌落总数(aerobic bacterial count)是指化妆品检样经过处理,在一定 的条件下培养后(如培养基成分、培养温度、pH 值、需氧性质等)，1g 或 1ml 检样中所含的菌落总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下 （在卵磷脂、吐温 80 营养琼脂上，于 37℃培养 48h）生长的嗜中温的需 氧及兼性厌氧性质的菌落总数。 3.2 水溶性样品：直接可溶于水的产品。 3.3 水不溶性样品：不能直接溶于水的油包水类产品或油相类原料。 4.4. 责任责任 现场品管员：负责半成品、成品完成后及包材的样品送样。 QC 理化室人员：负责原料的取样送样。 微生物室人员：负责实验的操作和结果的判断。 5.5. 检验材料和设备检验材料和设备 5.1 锥形烧瓶。 5.2 量筒。 5.3 pH 计或精密 pH 试纸。 5.4 样品瓶（100ml 蓝盖瓶） 5.5 灭菌平皿：直径 9cm。 5.6 灭菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml 5.7 酒精灯。 5.8 恒温培养箱。 5.9 放大镜。 5.10 天平 5.11 刮刀 6.6. 检验试剂检验试剂 6.1 生理盐水 6.2 卵磷脂吐温 80-营养琼脂培养基 6.3 吐温-20 6.4 TTC 溶液 7.7. 作业内容作业内容 7.1 培养基和试剂配制： 7.1.1 生理盐水： 成分：8.5 克氯化钠 1L 去离子水 7.1.2 卵磷脂、吐温 80-营养琼脂培养基 成分：卵磷脂、吐温 80-营养琼脂 去离子水 1000ml 7.1.3 吐温-20 成分：吐温-20 7.1.4 TTC 溶液 33g 成分：氯化三苯四氮唑 0.5g 去离子水 100ml 7.2 以上试剂均按实验需求分装后，松开瓶盖于 121℃，20min 高压灭菌 后，储存于冷暗处备用。 7.3 检验样品的预处理： 7.3.1 利用无菌操作将待检样品加入灭菌后的样品稀释瓶中： 7.3.1.1 水溶性样品，通常取 10.0～11.0 克于 90ml 已灭菌生 理盐水样品瓶中，如果送检样品少于 10 克的情况下， 取 1 克于 9ml 已灭菌生理盐水试管中稀释。 7.3.1.2 水不溶性样品，通常取 10.0～11.0 克于 10 克已灭菌 吐温- 20 样品瓶中进行乳化溶解后，再加入 80ml 已 灭菌生理盐水进行稀释；如果送检样品少于 10 克的情 况下，取 1 克于 1 克已灭菌吐温-20 试管中进行乳化 溶解后，再加入 8ml 已灭菌生理盐水进行稀释。 7.3.1.3 包材组件： 7.3.1.3.1 一般容器可用灭菌后的生理盐水进行冲洗， 稀释到培养液中。 7.3.1.3.2 一般小组件（如内塞、小勺子、无纺布等） 可直接塞于已灭菌生理盐水中。注：计数结 果按比例换算。 7.4 用灭菌吸管吸取 1:10 稀释的检液 2ml，分别注入到两个灭菌平皿内， 每皿 1ml。另取 1ml 注入到 9ml 灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接 触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，使成 1:100 稀释液。吸取 2ml, 分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1ml。如样品含菌量高，还可再稀 释成 1:1000，1:10000，1：100000，„„等，每种稀释度应换 1 支吸 管。 7.5 将熔化并冷至 45～50℃的卵磷脂、吐温 80-营养琼脂培养基倾注平皿 内，每皿约 15ml，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。 随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转 平皿，置 37℃培养箱内培养 48h。 7.6 为了便于区分化妆品中的颗粒与菌落，可在每 100ml 卵磷脂吐温 80 营 养琼脂中加入 1ml0.5%的 TTC 溶液，如有细菌存在，培养后呈红色， 而化妆品的颗粒则颜色无变化。 7.7 菌落计数方法 先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大 5～10 倍的放大镜检查， 以防遗漏。记下各平皿的菌落数后。求出同一稀释度各平皿生长的平 均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该 平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，面其余一半中菌落数 分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘 2，以代表全皿菌落 数。 7.8 菌落计数报告方法 7.8.1 首先选取平均菌落数在 30～300 之间的平皿，作为菌落总数测定 的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该 平皿菌落数乘其稀释倍数（见附表一、例１） 。 7.8.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在 30～300 个之间，则应求出 两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于或等于 2 应报告其平 均数，若大于 2 则报告其中较小的菌落数(见附表一、例 2 及例 3)。 7.8.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300 个，则应按稀释度最高的 平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见附表一、例 4)。 7.8.4 若所有稀释度的平均菌落数均少于 30 个，则应按稀释度最低的平 均菌落数乘以稀释倍数报告之(见附表一、例 5)。 7.8.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30～300 个之间，其中一个稀 释度大于 300 个，而相邻的另一稀释度小于 30 个时，则以接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见附表一、例 6)。 7.8.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于 10 个， 见附表一例 7； 7.8.7 菌落计数的报告，菌落数在 10 以内时，按实有数值报告之，大于 100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以 四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用 10 的指数来 表示(见下表报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注 明样品的稀释度。 7.9 附表一 不同稀释度的平均菌 例 次 10-110-210-3 落数 两稀释度 菌数之比 菌落总数 个/g或个 /ml 报告方式 个/g或个/ml 1136516420－16400 16000或 1.6×104 38000或 3.8×104 27000或 2.7×104 510000 或 5.1×105 22760296461.638000 32890271602.227100 4 不可 计 4650513-513000 527115-270 270或 2.7×102 31000或 3.1×104 〈10 6 不可 计 0 30512-30500 700-〈1*10