重叠PCR—overlapPCR

重叠重叠 PCRPCR——overlap PCRoverlap PCR 1.1.简介简介 重叠 PCR 也是基本的 PCR 原理： 变性-退火-延伸。 不同的是在重叠 PCR 过程是两个或者 几个片段重叠延伸之后，再进行指数扩增的PCR 过程。 2.2.基本原理基本原理 第一步：PCR 产生两个或者几个片段，这几个片段之间必须有重叠区。 第二步：以两个片段为例，见上图，第一步产生的两个片段，A D 链之间有互补，B C 链之 间也有互补，但只有 A D 链互补重叠延伸产生所需要的重叠片段。 第三步：第二步产生的重叠产物，在上下游引物的存在下，即可进行PCR 扩增过程。 请仔细看清楚原理，特别是第二步。 3.3.实际操作注意点实际操作注意点 a.第一步 PCR 之后的产物，可以纯化，也可以吸取几μL 作为重叠 PCR 的模板。 b.第二步和第三步一起称为重叠PCR，实际发生过程分为两个步骤。 c.Taq 酶会在末端加 A，高保真酶有 3’— 5’的外切活性， 基于重叠 PCR 原理和酶的性质， 第一步和重叠 PCR 步骤至少有一步使用高保真酶 （或者如 Taq Plus、Es Taq 之类的，有 3’ — 5’的外切活性） ，如果第一步和重叠 PCR 都使用普通 Taq 可能重叠 PCR 会失败。 d.基于重叠 PCR 原理，上图中第二步A D 链直接的退火很关键，所以有些protocol 会建议 重叠 PCR 分两个程序进行也是基于以上原理。 重叠区的 Tm 很关键， 或者说退火温度很重要。 4.4.重叠重叠 PCRPCR 几个应用场景几个应用场景 a.片段中间引入突变 b.片段中间引入缺失 C.片段中间引入插入片段 d.片段拼接(如不同结构域 DNA 片段拼接) e.长片段分段扩增，再重叠PCR 拼接。 f.从基因组扩增出外显子，再拼接出完整的CDS 区。