端粒和端粒酶的发现历程

端粒和端粒酶的发现历程端粒和端粒酶的发现历程 廖新化 引言引言 2009 年诺贝尔生理学或医学奖授予了 UCSF（加州大学旧金山分校）的 ElizabethBlackburn （简称 Liz） ，Johns Hopkins University（约翰霍普金斯大学）的 CarolGreider（简称 Carol） ， 以及 HowardMedicalSchool（哈佛医学院）的 Jack Szostak。诺贝尔奖主页上介绍她/他们获 奖的原因是揭示了 “how chromosomes are protected by telomeres and the enzymetelomerase”（染色体是 如何被端粒和端粒酶保护的） 。端粒和端粒酶的研究进程中贯穿着“发现现象/问题”-“提出概 念/模型”-“实验验证”的思路，整个过程就像相继解开一个个puzzle（智力谜团）一样有 趣，充满了思想的光辉。重现这个思路对科学工作者是有启发意义的。本文也提供了一个 很好的科学问题推演的教学案例。 染色体末端的两个难题以及端粒的概念染色体末端的两个难题以及端粒的概念 20 世纪 70 年代初，对 DNA 聚合酶特性的深入了解引申出了一个染色体的复制问题。DNA 聚合酶在复制 DNA 的时候必须要有引物来起始，而且它的酶活性具有方向性，只能沿着 DNA5’到 3’的方向合成。染色体复制之初可以由小RNA 作为引物起始合成，之后细胞的修 复机器启动，DNA 聚合酶能够以反链 DNA 为模板，以之前合成的DNA 为引物，合成新的 DNA 取代染色体中间的RNA 引物。但是线性染色体最末端的RNA 引物因为没有另外的引 物起始，没有办法被 DNA 取代。所以线性染色体DNA 每复制一轮，RNA 引物降解后末端 都将缩短一个 RNA 引物的长度（图 1，简化的示意图，实际上染色体的DNA 双链末端不 会是平的） 。尽管这个引物不长，但是细胞千千万万代地不断复制，如果不进行补偿，染色 体不断缩短，最终就会消失。 James Watson（因为发现 DNA 双螺旋结构获得诺奖）最早 就明确指出了这个“末端隐缩问题”，并猜想染色体也许可以通过在复制前联体（染色体末 端跟末端连起来）的方式来解决末端复制的问题[1]。 早在 1939 年，潜心玉米遗传性状研究的Barbara McClintock 女士（因为发现玉米的转座 子获得诺奖）注意到，在减数分裂后期偶然产生的染色体断裂很容易重新融合起来形成 “桥”。在紧接着的有丝分裂中，这种染色体“断裂－融合－桥－断裂”的循环不断继续[2]。 既然染色体的断裂末端这么容易相互融合，那么染色体的自然末端，为什么不容易相互融 合呢？合理的推测是，染色体的自然末端不同于非正常的DNA 断裂末端，它应该有一个特 殊的结构来避免染色体之间的相互融合。 更早的 1938 年，Hermann Muller（因为发明用 X 射线突变基因而获得诺奖）利用X 射线 照射果蝇产生突变体，注意到染色体的末端跟其它区域的染色体不同，它非常稳定，从未 观测到断裂缺失或者倒位（inversion） 。他因此先见性地认为染色体的末端比较特殊，它需 要被封闭（sealed）起来，并给它一个专有的名称-端粒（telomere，来自希腊词根 telos， 末端，和 meros，部分）[3]。 端粒端粒 DNADNA序列的发现以及人工染色体的发明序列的发现以及人工染色体的发明 那么端粒为什么与众不同呢？简单地，首先是，它的DNA 序列有没有特殊性？ 提到端粒不能不提到一种特殊的模式生物四膜虫（Tetrahymena thermophila） 。它对于发 现端粒和端粒酶的贡献就像线虫之于发现细胞凋亡一样（2002 年细胞凋亡的研究被授予诺 奖） 。四膜虫有两个细胞核。小核很稳定，含5 对染色体，用于生殖传代。而大核在接合细 胞的发育过程中，染色体断裂成200-300 个小染色体，rDNA（含有编码核糖体 RNA 的基 因）从染色体上断裂后通过复制更是形成高达～10000 个小染色体。 四膜虫的小染色体众多，也就说端粒可能非常丰富。这就为端粒研究提供了得天独厚的材 料。1978 年，Liz 女士利用这种特殊的模式生物纯化了rDNA，以 rDNA 为模板通过体外合 成参入 dNTP 的实验，推断四膜虫的端粒是由许多重复的5’-CCCCAA-3’六个碱基序列组成 的[4]。第一个谜底揭开了，哦，重复序列，端粒DNA 果然特殊。序列本身隐隐暗示着解 决染色体末端的隐缩问题和保护问题的机制。 1980 年，当 Liz 女士在会议上报告她的这一发现的时候，引起了Jack Szostak 的极大兴 趣。他那时候试图在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中建构人工线性染色体，让它 能够在细胞中像自然染色体一样复制。但是当环状质粒线性化转入酵母细胞后，它很快地 被降解掉。它的降解是不是因为它的末端没有端粒保护呢？端粒序列的发现让 Jack Szostak 有机会把线性质粒末端连接上四膜虫的端粒DNA，然后再导入酵母细胞。奇 迹发生了，线性质粒不再降解，它可以在细胞内复制，人工染色体的想法实现了！[5] 值得一提的是，人工染色体的实现当初也许仅仅是满足人们的异想天开，但它实际上使 DNA 的大片段克隆成为可能，后来为人类基因组测序的工作立下了汗马功劳。这也是 Jack Szostak 共同获得诺贝尔奖的重要原因。 1984 年，Liz 实验室通过将酵母端粒克隆到线性人工染色体的方法，发现酵母的端粒序列 是由不太规则的 TG1-3/C1-3A重复序列组成的[5, 6]。 端粒复制的两个假说以及端粒酶活性的发现端粒复制的两个假说以及端粒酶活性的发现 在 1984 年报道酵母端粒序列的同一篇文章中，Liz 实验室发现了一个有趣的现象：带着四 膜虫端粒 DNA 的人工染色体导入到酵母后，被加上了酵母的端粒而不是四膜虫的端粒序列 [6]。由于端粒是由重复序列组成的，当时人们普遍猜想同源重组是延伸端粒补偿染色体末 端隐缩的机制。但是同源重组只能复制出更多本身的序列，为什么在四膜虫端粒上加的是 酵母的端粒序列而不是四膜虫端粒本身的序列呢？这个现象同源重组是无力解释的。也 许，酵母中存在专门的 “酶”来复制端粒 DNA。 究竟是重组还是全新的酶？为了厘清这两个假说，Liz 意识到最重要的是找到这个“酶”。 如前所述，在四膜虫接合细胞的大核发育过程中，大核产生了非常丰富的小染色体，每一 个小染色体都被从头加上了端粒。可以推测，如果“酶”的假说成立，此时细胞内的“酶”活 性应该是非常高的。 1984 年，Carol 女士作为博士生加盟了Liz 实验室。她们俩精心讨论设计实验，用四膜虫 的核抽提液与体外的端粒DNA 进行温育，试图在体外检测到这个“酶”活性，看到端粒的延 伸。经过不断优化条件，尤其是把底物换成体外合成的高浓度的端粒DNA 后，同年的圣诞 节，勤奋的 Carol 同学打开暗盒曝光 x 光片，终于清楚地看到了“酶“活性。在测序胶的同位 素曝光片上，端粒底物明显被从新加上了DNA 碱基，而且每六个碱基形成一条很深的带， 与四膜虫