细胞总RNA的提取操作步骤

细胞总细胞总 RNARNA 的提取操作步骤的提取操作步骤 一、 准备 1、 物品:Trizol、氯仿(三氯甲烷)、异丙醇、75%灭酶异醇、冷 PBS、1.5ml 灭酶 EP 管、灭酶枪头、一次性手套、EP 管架、吸管 2、 打开冷冻离心机 4?预冷 二、操作步骤: 将 Trizol、氯仿、冷 PBS、EP 管、灭酶枪头、一次性手套、EP 管架、吸管等 物品带入细胞室。 1、 取出 EP 管、做好标记 2、 取出细胞、收集上清保存备用 3、 用冷 PBS 冲洗细胞两次 4、 加入 1ml Trizol (24 孔板每孔加 0.5ml 即可)，调小刻度用移液器吹打细 胞至液体澄清(生化:摇动混匀后室温孵育 10min) 5、 将裂解液转移至 1.5ml 灭酶 EP 管中，用黄枪头加入氯仿 0.2ml(1/5 Trizol 体积)，用手剧烈震摇 15 秒，置室温 5min(生化:3min dxyer:15min)，分层 6、 4?、12000g(12300rcf)离心 15min，可见分层。 7、 用黄枪头小心收集上层水相约 0.5ml 置于另一 1.5ml 灭酶 EP 管中(确保不 要吸入中间层和有机相)。 8、 各管分别加入 0.5ml 异丙醇(等体积)，用力摇匀，置室温 10min。(提前 将异丙醇 4?预冷，或混匀后置-20? 60min，提取效果更好) 9、 4?、 12000g 离心 10min，可见 RNA 沉淀。 10、倒弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的 75%灭酶异醇 1ml，用指轻 弹管壁使 RNA 沉淀飘起 洗涤。 11、4?、7500g(7700rcf)离心 5min，生化为 10min，(亦有 dxyer 用 12000g)， 沉淀即为总 RNA。 12、弃上清，真空干燥约 4min 或空气中干燥 5~10min，加入 20µl(30µl)DEPC 水。 56?水浴小于 10min 助溶，取少量测 OD 值，其余-70?保存备 RNA 制备的问题与解答 1、塑料制品、玻璃和金属物品的处理 (a)塑料制品:尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明 RNase-Free 的塑料 制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都 必须处理方可使用。处理方法如下: (1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC 使 DEPC 的终浓度为 0.1%。注 意:DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 (2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEPC 水溶液， 使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 (3)在通风柜中室温处理过夜。 (4)将 DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEPC 水处理过的塑料 制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。 (5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 (b)玻璃和金属物品 250?C 烘烤 3 小时以上。 2、RNase 是 RNA 制备的杀手 RNase 酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以 暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白 抑制剂都不能是 RNase 完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与 RNA 制备 有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase 的又一污染源是取液器。根据取液 器制造商的要求对取液器进行处理。 一般情况下采用用 DEPC 配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要 求。取 RNase-free 的物品时必须戴手套。 3、采用什么方式纯化总 RNA, 答:我们提供多种 RNA 纯化方式，根据您对 RNA 纯化技术的熟悉程度，选用不 同的纯化手段。从产品使用效果看，基于 TriBlue 的一步法分离总 RNA 试剂盒 (K311,K321 系列)无论是新手还熟手都可以得到比较理想的结果。如果您对苯酚过 敏，出于对环境的保护，您可以选用整个分离流程都不使用苯酚的试剂盒(K361 系 列)。从产品形式上，我们的总 RNA 分离分醇沉淀离心式和离心吸附柱方式两种。 沉淀方式总的产量比较高，纯化规模机动，但是纯度不及吸附柱方式;吸附柱方式 操作比较简单，纯度高，受吸附容量的影响，产量收到影响。 4、什么时候需要分离 mRNA? 答:常规 RT-PCR 鉴定基因表达水平的，一般都可以采用总 RNA 作为 RT-PCR 的 模板，但是做 cDNA 文库，克隆丰度极低的基因，大多数 DD-PCR， 削减杂交等需 要纯化的 mRNA。一般用 oligo (dT)-cellulose 或在磁珠上偶连 oligo (dT)，从组 织或总 RNA 种直接分离 mRNA。 5、如何判定分离的总 RNA 的纯度, 答:需要从两个方面着手，缺一不可，特别是新手(1)测定 OD260/OD280 的比 值，测定时，RNA 需要用 10mM Tris-HCl,pH7.5 稀释。理想的 RNA, OD260/280 在 1.9-2.1 之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高 RNA 可能已发生降解。(2) 琼脂糖变性电泳观察 rRNA 的完整性和强度。变性电泳需要采用 MOPS 系统，不可以 采用 DNA 电泳用的 TBE 或 TAE 系统。如果 OD260/OD280 过低(1.7)，通常可以通 过减少组织和细胞的用量来实现。 6、什么时候需要加入 RNA-Carrier? 答:样品很少或样品中 RNA 含量低，制备 RNA 时需要加入一定的 RNA 载体，以 提高 RNA 纯化的得率。常用的载体有 PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C 和 Glycogen。一定浓度范围的 Carrier 对一些 RNA 的下游应用没有影响，如 RT-PCR, Northern Blot。 7、如何除去纯化的 RNA 中微量的基因组 DNA? 答:无论用种方式制备的总 RNA,要绝对保证不含基因组 DNA 是不现实的。如果 您希望得到 DNA free 的 RNA 样品，需要用 RNase free 的 DNase I 处理。 8、纯化的 RNA 样品如何保存, 答:如果希望得到最佳的结果，纯化的 RNA 需要立即用于下游实验。RNA 可以保 存在-80C 冰箱，长期保存可以置于液氮中。如果没有-80 冰箱或液氮，RNA 也可以 保存在异丙醇或乙醇中，-20 度保存。 9、组织和细胞样品如何收集，保存, 答:组织样品收集后，需要立即保存在液氮中，或在样品中加入一定量的保护 剂，有一些商业化的产品可以选用。一般实验收集 50-100mg 组织就足够了。 10、如何估计 RNA 的产量, 答:能计算出 RNA 的产量，通常都是有比较多的起材料，但是很多情况下能够 取得材料很少，所制备得到的 RNA 无法通过分光光度的方法测定含量和浓度。RNA 的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系, 同时与抽提的方式有关，例如用抽提 小鼠组织 100mg 肝可以得到 500ug 总 RNA, 100mg 肺 得到 200ug 总 RNA, 1 百万个 细胞 Hela 细胞可以得到 15ug