基因工程复习资料 精心整理

第一章 绪论 1.基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。 2.基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现 3.基因工程的基本步骤 （1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 （2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 （3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 （4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。 （5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 4.基因工程的意义 （1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。 （2）基因工程在工业中的应用： 1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。 2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。 （3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物； 用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂--疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。 （4）基因工程在环境保护中的作用： 1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染 2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。 （5）基因工程商业化的发展 第二章 基因工程主要技术原理 1．质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么 质粒的提取和纯化方法 最常用的为碱抽提法： 原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快。染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。 步骤：1）溶菌：溶液I（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA,4-5mg/ml 溶菌酶） 2）破膜：溶液II（0.2N NaOH 1.0%SDS） 3）中和：溶液III（3M醋酸钠 pH4.8） 4）离心 5）转移：将上清转移到一个新的离心管中 6）抽提：酚-氯仿抽提，酚/氯仿/异戊醇—25/24/1 7）沉淀：用0.6倍体积的异戊醇或2倍体积的乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸铵辅助沉淀） 23 / 1 基因组DNA的提取纯化方法 （1） 细菌基因组DNA的制备 细胞裂解（10%SDS和蛋白酶K。SDS是阴离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。 ）—>DNA纯化（CTAB(十六烷基三甲基溴化铵) 除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。 ）—>沉淀DNA（0.6倍体积的异丙醇或2倍乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）） （2） 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提 组织粉碎（动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末；组织培养的细胞用胰酶消化 松散后直接使用。）—>细胞裂解（0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50℃温育。）—>沉淀DNA（用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇。（加入1/10体积的3M醋酸氨可以辅助沉淀）。） （3） 从植物组织中制备 DNA 组织粉碎（用液氮冷冻后研磨成细粉末。）—>细胞裂解（用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基 溴化铵/2巯基乙醇）或1% SDS和蛋白酶K。 65 ℃温育。）—>沉淀DNA（用0.6倍体积的异丙醇（-20℃）。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）） 2.DNA的定量和纯度测定方法 （1）紫外光谱法： DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，蛋白质在280nm波长处有特异的紫外吸收峰 ，对于纯DNA： OD260/OD280 =1.8，若低于1.8说明有蛋白质杂质 （2）琼脂糖凝胶电泳估计 溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。 3.琼脂糖凝胶电泳基本原理及应用 原理：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。相同分子量的DNA：闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开放开环状最慢。 琼脂糖凝胶电泳的应用：用于对DNA分子量的估计，DNA片段的分离和回收。 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳 1111- ，-甲叉双丙烯酰胺(N聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide)和交联剂NN，Nmethylene bisacrylamide)在催化剂的作用下聚合而成。引发剂：过硫酸铵，加速剂：TEMED。电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。凝胶浓度越大，空隙越小。电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片。 5.核酸杂交原理、类型及应用 原理：核酸分子杂交技术是依据核酸分子碱基互补、变性和复性原理，用标记的已知序列的单链核酸片段(DNA或RNA)作为探针,与未知的核酸片段进行杂交, 形成异源性杂交分子，然后通过标记信号的检测，鉴定样本中是否存在与探针互补的靶序列DNA。包括：DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。 特点：特异性高；灵敏度高；定位准确 应用：基因克隆的筛选；酶切图谱制作；基因组中特定基因序列的定量和定性检测； 基因表达的分析；基因突变分析；疾病的诊断、微生物病原体检测。 变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。 23 / 2 ，此时melting temperature,Tm)1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（A260值达到最大值 C含量有关。Tm与核酸的G、50%的DNA分子发生了变性。0.41+69.3 %×（G+C）Tm= Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。 DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。复性：在适当条件下，变性即可恢复双链螺旋℃时，变性的单链DNATm值低20-30在热变性后，当温度缓慢冷却至比 结构，这样的复性又称为退火。在杂交前可用封闭物将这预杂交：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的