SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量 一. 实验目的 1.学习 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 3.运用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及染色鉴定。 二 .实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis） 通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形 成的三维空间的高聚物。 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。 具有浓缩效应、 电荷效应、 分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25 个组分。因此适用于不同 相对分子质量物质的分离，且分离效果好。 SDS 是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。在含有强还原剂的SDS 溶液中可形成 SDS-蛋 白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身 带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。 人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能： Acr：丙烯酰胺 Bis：甲叉双丙烯酰胺 AP：过硫酸铵——化学催化剂 TEMED：四甲基乙二胺——加速剂 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基磺酸钠） ， SDS 能断裂分子内和分子间氢键， 破坏蛋白质的二级和三级结构， 强还原剂能使半胱氨酸之间的 二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS 溶液中，与 SDS 分子按比例结合， 形成带负电荷的 SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原 有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块， 从而降低或消除了各种蛋白质 分子之间天然的电荷差异，由于SDS 与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳 时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD 到 200KD 之间时，蛋白质 的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X 为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可 获得一条标准曲线， 未知蛋白质在相同条件下进行电泳， 根据它的电泳迁移率即可在标准曲 线上求得分子量。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中， 特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。 影响它们结合的因素主要有三个： 1 溶液中 SDS 单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与 SDS 结合的重量比 为 1:1.4，如果单休浓度降到 0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为 1: 0.4 这样就不能消除 蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS 的充分结合，它们的重量比应该为1:4 或 1:3 2 样品缓冲液的离子强度。SDS 电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～100mmol/L 3 二硫键是否完全被还原 采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时， 只有完全打开二硫键， 蛋白质分子才 能被解聚，SDS 才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因 此在用 SDS 处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的 二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS 定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在 SDS 和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的 亚基或单条肽链的 MW。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE 测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有 较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。 PAGE 电泳中各种成分及其作用 过硫酸铵：凝胶聚合的催化剂（过量会使离子强度升高。）， 四甲基乙二胺：加速剂。（碱性条件下容易聚合） 丙烯酰胺与双丙烯酰胺（P133)二者总浓度及相对比例决定凝胶的孔径、交联度，硬度及弹 性。 浓缩胶与分离胶 浓缩胶：胶浓度低，交联度低，pH=6.7，蛋白带负电荷少，大孔胶。 pH=6.7 时，电极缓冲 液中甘氨酸负离子解离较少（慢离子），氯离子是快离子，蛋白迁移速率介于两者中间，局 部电位梯度大，（快离子移动快，形成局部低电导区，产生高电位，使移动加快）从而产生 浓缩效应。 分离胶：胶浓度高，交联度高， pH=8，蛋白带负电荷多，小孔胶， pH=8.0 时，电极缓冲 液中甘氨酸负离子解离较多，与氯离子一样， 迁移速度加快，蛋白迁移速率最慢，部电位梯 度小。 不连续性：孔径大小不连续，离子成分不一样，移动速度不一样 三. 实验试剂和器材 2.实验试剂 ) ( 30%丙烯酰胺 （Acr）： 称 Acr30g， 甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g， 加蒸馏水至 100ml， 过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用 1-2 月。（2） 10%SDS （十二烷基磺酸钠） (约 0.28M) （3）1.5mol/L pH8.9 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入 50ml 水，用1mol/L 盐 酸调 pH8.8， 最后用蒸馏水定容至 100ml。（分离胶缓冲液，含0.4%SDS） （4） 0.5mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液： 称取Tris12.1g， 加入 50ml水， 用 1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至 100ml。(浓缩胶缓冲液） （5） （7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品缓冲液液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至 10ml。 （10）固定液：取 50%甲醇 454ml，冰乙酸 46ml 混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸 75ml，甲醇 50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13） SDS 电极缓冲液 （内含 0.1%SDS， 0.025mol/LTris- 0.192mol/L甘氨酸缓冲液 pH8.3） ： 称 Tris6.0g，甘 氨酸 28.8g，加入 SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至2000ml。 3.实验器材 垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液管 滤纸 微量注射器 大培养皿 四. 实验过程 各部分凝胶配制 分离胶 12.5%浓缩胶 5% 分离胶缓冲液：3.0 毫升浓缩胶缓冲液：3.0ML 丙烯酰胺贮备液：5.0ML丙烯酰胺贮备液：1.0ML 10%过硫酸胺： 120 微升 10%过硫酸胺：60 微升 水4.0ML2ML TEMED:12 微升 6 微升 混匀后灌胶，水封 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备 2 个干净的锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. . 3. 按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约 5 厘米左右,之后加少