western-blot试验步骤

Western boltWestern bolt 一、实验目的 通过实验了解 western blot 技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式 ,特别是用于蛋白质纯度 检测和测定蛋白质分子量。 PAGE 能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电 荷的差异,而 SDS-PAGE 的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基 硫酸钠），SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS 的量几 乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关， 因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺 凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4g 去污剂结合。当分子量在15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量 的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X 为迁移率， k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可 获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称 NC 膜)，在胶体金 试纸中用做 C/T 线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC 膜是生物学试验 中最重要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结 合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光 HRP 底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL 试剂）是目前 Western blot检测中最为灵敏的试剂。 显影液的 A 液主要成分为鲁米诺 （Luminol） 及发光增强剂，B 液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有 HRP（辣根过氧化 物酶），可以催化 A 液和 B 液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC 膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X 射线摄影暗匣 8.X 射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g Glycine 94.0g SDS 5.0g ddH2O定容至 1L 使用前稀释 5 倍 2.Transfer buffer 10×Transfer buffer(1L) Tris 30.3g Glycine 144.0g ddH2O定容至 1L 使用前稀释 10 倍，加入 1/4 体积的甲醇 3.TBS 10×TBS(500mL) Tris 12.1g Nacl 40.0g ddH2O定容至 500mL 用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.6 4.TBST(1L) 1×TBS:Tween-20=1000:1 ddH2O 定容至 1L 5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml) 脱脂奶粉 2.5g TBST定容至 50ml 6.一抗溶液 7.二抗溶液 8.显影液现配现用，溶液 A：溶液 B=1:1 配置。 9.SDS-PAGE（配方见下一页） 五、操作步骤 1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.1SDS-PAGE 胶的配置 ①先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。 ②准备好试剂。 ③计算所需要使用试剂的量。 例：6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要 7ml，10 块胶，共需要 70ml ④将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板有 正反之分，上面的“up”朝上。 ⑤准备配胶按照上面配方依次添加。 注意：1.添加量少的试剂要注意混匀 2.TEMED，APS 要最后加 ⑥配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越 是浓度高的胶液凝的越快。 ⑦分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面， 注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢 不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。 ⑧半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。凝 结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。 ⑨配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约 3ml。 注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子的 时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。 A.A.分离胶分离胶 6%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 8%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 10%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 12%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 5ml 2.1 1.5 0.05 0.05 0.002 7ml 2.94 2.1 1.82 0.07 0.07 0.0028 8ml 3.36 2.4 2.08 0.08 0.08 0.0032 10ml 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 5ml 2.35 1.25 0.05 0.05 0.002 7ml 3.29 1.75 1.82 0.07 0.07 0.0028 8ml 3.76 2 2.08 0.08 0.08 0.0032 10ml 4.7 2.5 2.6 0.1 0.1 0.004 5ml 2.6 1 0.05 0.05 0.003 7ml 3.64 1.4 1.82 0.07 0.07 0.0042 8ml 4.16 1.6 2.08 0.08 0.08 0.0048 10ml 5.2 2 2.6 0.1 0.1 0.006 5ml 2.85 0.75 0.05 0.05 0.004 7ml 3.99 1.05 1.82 0.07 0.07 0.0056 8ml 4.56 1.2 2.08 0.08 0.08 0.0064 10ml 5.7 1.5 2.6 0.1 0.1 0.008 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 15%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 5ml 1.725 1.875 0.05 0.05 0.002 7ml 2.415 2.625 1.82 0.07 0.07 0.0028 8ml 2.76 3 2.08 0.08 0.08 0.0032 10ml 3.45 3.75 2.6 0.1 0.1 0.004 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 B.B.浓缩胶浓缩胶 5%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 2.02ml 1.48 0.25 0.02 0.0