westernblot试验步骤

W We es st te er rn nb bo ol lt t 一、实验目的 通过实验了解 westernblot 技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式 ,特别是用于蛋白质纯度检测 和测定蛋白质分子量。PAGE 能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差 异,而 SDS-PAGE 的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸 钠），SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS 的量几乎总 是与多肽的分子量成正比而与其序列无关， 因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶 电泳中的迁移率只与多肽的大小有关， 在达到饱和的状态下， 每克多肽可与 1.4g 去污剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对 数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X 为迁移率，k、b 均为常数， 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一 条标准曲线， 未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标 准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，简称 NC 膜)，在胶体金试纸中 用做 C/T 线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC 膜是生物学试验中最重 要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即 抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光 HRP 底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为 ECL 试剂）是目前 Westernblot检测中最为灵敏的试剂。 显影液的 A 液主要成分为鲁米诺 （Luminol） 及发光增强剂，B 液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有 HRP（辣根过氧化物 酶），可以催化 A 液和 B 液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC 膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X 射线摄影暗匣 8.X 射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris15.1g Glycine94.0g SDS5.0g ddH2O 定容至 1L 使用前稀释 5 倍 2.Transferbuffer 10×Transferbuffer(1L) Tris30.3g Glycine144.0g ddH2O 定容至 1L 使用前稀释 10 倍，加入 1/4 体积的甲醇 3.TBS 10×TBS(500mL) Tris12.1g Nacl40.0g ddH2O 定容至 500mL 用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.6 4.TBST(1L) 1×TBS:Tween-20=1000:1 ddH2O 定容至 1L 5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml) 脱脂奶粉 2.5g TBST 定容至 50ml 6.一抗溶液 7.二抗溶液 8.显影液现配现用，溶液 A：溶液 B=1:1 配置。 9.SDS-PAGE（配方见下一页） 五、操作步骤 1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.1SDS-PAGE 胶的配置 ①先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。 ②准备好试剂。 ③计算所需要使用试剂的量。 例：6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要 7ml，10 块胶，共需要 70ml ④将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板有 正反之分，上面的“up”朝上。 ⑤准备配胶按照上面配方依次添加。 注意：1.添加量少的试剂要注意混匀 2.TEMED，APS 要最后加 ⑥配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越 是浓度高的胶液凝的越快。 ⑦分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面， 注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢 不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。 ⑧半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。凝 结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。 ⑨配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约 3ml。 注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子的 时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。 A.A.分离胶分离胶 6%GEL H2O 40%Acr/bis 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10%SDS 5ml 2.85 0.75 1.3 7ml 3.99 1.05 1.82 8ml 4.56 1.2 2.08 10ml 5.7 1.5 2.6 0.050.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110%AP（过硫酸0.05 铵） TEMED 8%GEL H2O 40%Acr/bis 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10%SDS0.05 0.004 5ml 2.6 1 1.3 0.0056 7ml 3.64 1.4 1.82 0.0064 8ml 4.16 1.6 2.08 0.008 10ml 5.2 2 2.6 0.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110%AP（过硫酸0.05 铵） TEMED 10%GEL H2O 40%Acr/bis 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10%SDS 0.003 5ml 2.35 1.25 1.3 0.0042 7ml 3.29 1.75 1.82 0.0048 8ml 3.76 2 2.08 0.006 10ml 4.7 2.5 2.6 0.050.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110%AP（过硫酸0.05 铵） TEMED 12%GEL H2O 40%Acr/bis 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10%SDS0.05 0.002 5ml 2.1 1.5 1.3 0.0028 7ml 2.94 2.1 1.82 0.0032 8ml 3.36 2.4 2.08 0.004 10ml 3.3 4.0 2.5 0.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110%AP（过硫酸0.05 铵） TEMED 15%GEL H2O 40%Acr/bis 0.002 5ml 1.725 1.875 0.0028 7ml 2.415 2.625 0.0032 8ml 2.76 3 0.004 10ml 3.45 3.75 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10%SDS 1.31.822.082.6 0.050.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110%AP（过硫酸0.05 铵） TEMED B.B.浓缩胶浓缩胶 0.0020.00280.00320.004 5%GEL H2O 40%Acr/bis 1.0Mtris-HCl （pH6.8） 10%SDS 2.02ml 1.48 0.25 0.25 4.04ml 2.96 0.50 0.50 6ml 4.44 0.75 0.75 10ml 3.4 0.83 0.6