SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

项目三项目三 SDSSDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）测定蛋白质分子量）测定蛋白质分子量 一实训目的 1 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作步骤 2 学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 二实训原理 用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质 （protein） ， 主要依赖于电荷效应和分子筛效应。 再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必 须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS 能破坏 蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性 解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负 离子， 因此， 当电泳时， 蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小， 当蛋白质分子量在 1.2X104～ 16.5X104之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。 LogMW＝K－bm (LogMW 为分子量的对数，K、b 为常数，m 为迁移率) 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线， 未知蛋 白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量. 三、实训器材 序号 1 2 3 4 5 6 序号试剂 1 2 3 低分子量标准蛋 白质样本 样品 浓缩胶缓冲液 纯度、浓度 2mg/ml 10~20mg/ml 作用 以标准样品为对照即可确定 样品各区带的成分 作为实验组来测定蛋白质的 分子量 配制方法 见 表 格 下 方 同上 需要工具 水浴锅、小烧杯，玻 璃棒 水浴锅、小烧杯，玻 璃棒 天平、容量瓶、棕色 试剂瓶 设备名称 垂直板电泳槽及附件 直流稳压稳流电泳仪 微量进样器 玻璃注射器 玻璃平板 电炉 规格，型号 可变压 数量 1 1 2 1 4 1 呈弱酸性，使甘氨酸解离很同上 少，在电场作用下，涌动效率 低，二氯离子含量高，形成较 高的电位梯度压着蛋白质聚 集在一起，凝缩为一狭小区 带。 呈碱性，甘氨酸解离度大，涌同上4分离胶缓冲液天平、容量瓶、棕色 动速率增加，紧随氯离子之 后，在电场作用下，蛋白质根 据其固有的电性得到分离。 5 6 7 电极缓冲液 过硫酸铵（AP） SDS 1% 1% 保证电泳的 PH，起传播电流同上 作用 作为催化剂，产生自由基，加同上 速凝胶聚合。 去掉其电荷效应， 使样品的蛋同上 白质分子的迁移率完全取决 于分子量 使蛋白质固定在凝胶上， 便于 后续过程中色普带的确定 脱去凝胶上的染色液， 使蛋白 质谱带清晰 保存凝胶，便于下次使用 便于观察蛋白质在凝胶电泳 中的位置，有利于调节电流 同上 同上 同上 同上 同上 同上 使蛋白质变性， 固定在凝胶上同上 试剂瓶 1000ml 的容量瓶、天 平 天平、容量瓶 天平、100ml 容量瓶 8 9 10 11 12 13 14 15 样品缓冲液 样本变性液 固定液 染色液 脱色液 保存液 指示染料液 TEMED 天平、100ml 容量瓶 天平、100ml 容量瓶 天平、100ml 容量瓶 天平、100ml 容量瓶 天平、100ml 容量瓶 天平、100ml 容量瓶 天平、100ml 容量瓶 天平、100ml 容量瓶加速剂， 可催化过硫酸铵产生同上 自由基， 从而加速丙烯酰胺的 聚合 配制方法 1、浓缩胶缓冲液：1.5 克 Tris、12.0 毫升 1mol HCl，加水混匀定容至 25 毫升。 2、分离胶缓冲液：18.15 克 Tris、48.0 毫升 1 mol HCl，加水混匀定容至 100 毫升。 3、电极缓冲液：3 克 Tris，14.4 克甘氨酸、1 克 SDS，加水混匀定容至 1000 毫升。 4、1％过硫酸铵：1 克过硫酸铵溶于 l00ml 蒸馏水中，临用前配制。 5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8I＝0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B 液)1：7(v/v)稀释。 6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8I=0.01M，2％SDS， 10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；0.8 克 SDS， 4 克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20 毫升， 再 1 滴 0.1％溴酚兰。 使用时与样本 l:1(v/v)混匀。 7、固定液：57.0 克 TCA，17.0 磺基水杨酸，150 毫升甲醇，加水 350 毫升混匀。 或 25％异丙醇和 10％乙酸的混合液中 1h，蛋白质就得到固定了。 8、染色液：1.25 克考马斯亮兰 R-250，227 毫升甲醇，227 毫升水，46 毫升冰乙酸混匀，滤 纸过滤。 9、脱色液：10％乙醇-70％醋酸。100 毫升乙醇，70 毫升醋酸加水混匀定容至1000 毫升。 10、保存液：10％乙醇-10％醋酸-10％甘油，100 毫升乙醇，100 毫升醋酸，100 毫升甘油加 水混匀定容至 1000 毫升。 11、指示染料液：0.1 溴酚兰(BPB)，100 毫克溴酚兰溶于 100 毫升水中。 四、实训步骤 （一）制备聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 电泳槽的安装： 干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5％的琼脂密封。 2. 样品处理： 将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度 2mg/ml），在沸水中加热 3～ 4min，待冷却后作点样用。 3. 制胶：选择合适的胶浓度按下表配制7.5％的分离胶，（为小孔胶，进行电泳和分子筛分 离） 1、分离胶的制备：10％（催化剂过硫酸铵，加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED） 试剂分离胶 （10％）（单位：ml） A 液3 C 液1.85 蒸馏水3.5 1%TEMED0.6 E0.05 总量 9ml，化学聚合 30－60 分钟 2、浓缩胶的制备：4.5％为大孔胶，进行样品浓缩， 试剂浓缩胶 （10％）（单位：ml） A 液0.43 C 液1.25 蒸馏水0.9 1%TEMED0.25 E0.015 总量 2.845ml，光聚合 30－60 分钟（催化剂核黄素，加速剂（TENED） 混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间 （小心不要产生气泡） ，加到距短玻璃板上边缘 3cm 处，立即覆盖 2～3mm 水层，静止聚合约 40min 左右。胶聚合好的标志是胶与水之间 形成清晰的界面。吸取分离胶的水分， 将配制好的浓缩胶注入分离胶之上， 立即插上有机玻 璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。 4. 点样： 用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5μl，按分子量（从小到大）的顺序注入样品槽内 的浓缩胶面上，同时吸取待测样品液 25μl，注入其它样品槽内，在样品上小心地注入电极 缓冲液。 5. 电泳： 加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为15mA，当指示剂进 入分离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80～100 伏之间，约3～4h 后，指示剂达到 距前沿 1～2cm 时，可终止电泳。 6. 固定： 胶取出后，在水中浸泡 10min，浸出部分 SDS，然后将胶浸泡在 25％异丙醇和 10％乙酸的 混合液中 1h，蛋白质就得到固