SDS-PAGE-蛋白电泳分析

SDSSDS－－PAGEPAGE 蛋白电泳分析蛋白电泳分析 一、一、 目的目的 掌握 SDS-PAGE 电泳原理与方法 二、二、 电泳原理电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称 Acr) 和交联剂 N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简 称 Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行 电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产 生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带， 如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质， 蛋 白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白 质分子结合成复合物， 使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷， 掩盖了各种蛋白 分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电 荷和分子形状的影响， 而只是棒长的函数。 这种电泳方法称为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （简 称 SDS—PAGE）。由于 SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小 到可以略而不计的程度， 因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度， 如果被鉴定的蛋白质 样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质， 那么 SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。 三、三、 试剂配制试剂配制 1． 30% 丙烯酰胺： 将 29g 丙烯酰胺和 1g N， N’ -亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的 水中。加热至 37℃溶解之，补加水至终体积为 100ml。用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除 菌，查证该溶液的 pH 值应不大于 7.0，置棕色瓶中保存于室温 (丙烯酰胺具有很强的神经 毒性并可以通过皮肤吸收， 其作用具累积性。 称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和 面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。 2． 1M Tris-Cl: 称取 12.191g Tris 碱溶于 80ml 蒸馏水中，用浓 HCl 调到所需 pH 值， 定容至 100ml。 1.5M：Tris 碱 18.15g 去离子水 80ml 浓盐酸调 PH 值 8.8 加去离子水定容至 100ml 3． 1 M DTT： 称取 3.09 g DTT， 加入到 50 ml 塑料离心管内， 加 20 ml 的 0.01 M NaOAc （pH5.2)，溶解后使用 0.22 mm 滤器过滤除菌适量分成小份后，-20℃保存。 4． 10% SDS: 20g SDS 溶于 200ml 纯水中。 5． 10% 过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶于 10ml 纯水中，现用现配。 6． 2×SDS 上样缓冲液：1.0 mol/L Tris-Cl(pH6.8)10ml，10%SDS 40ml，50%甘油 40ml， 0.2g 溴芬蓝，定容至 100ml。 7． 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，3g Tris 碱和 18.8g 甘氨酸，加入 10ml 10%SDS，用去离 子水补至 100ml， 配制成 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液； 取 50ml 10×缓冲液， 稀释至 500ml， 配制成工作浓度 1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 8． 考马斯亮蓝 R250 染色液：1gR250 溶于 250ml 异丙醇、100ml 冰乙酸和 650ml 去离 子水的混合液中，过滤去除颗粒状物。 9． 脱色液：乙醇/水/冰乙酸分别为 50ml,850ml 和 100ml。 四、四、 实验方法实验方法 1．10%分离胶的配制 7ml(小板为 5ml)：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，加水封胶待 凝固。 2．吸干封液的水，倒浓缩胶。 3. 5%浓缩胶的配制 3ml：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，插入梳子待凝固。 3．取下梳子，用蒸馏水冲洗梳孔，洗净其中的残余胶块，用滤纸吸干。 4．将制成的胶放入电泳槽内，倒入 1×甘氨酸电泳缓冲液，观察不渗漏即可。 5．取 10μl 样品，加入等体积的 2×SDS 上样缓冲液，样品与蛋白质 Maker 100℃保温 5min。 6． 分别取 10μl 上样，110V 恒压电泳 2～3 小时。 7． 将胶剥下至一平皿中，加入考马斯亮蓝染色 1～2 小时，回收染色液后，倒入脱色液脱 色过夜， 其间换脱色液 1～2 次。 五、五、 实验结果实验结果 观察电泳结果，分析蛋白大小，结合实验一，通过蛋白条带的变化分析细胞破碎效果 六、见附录六、见附录 1 1：分离胶和浓缩胶配方表：分离胶和浓缩胶配方表 常见问题分析： 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在 SDS－PAGE不连续电泳中， 制胶缓冲液使用的是Tris－HCL 缓冲系统， 浓缩胶是 pH6.7， 分离胶 pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱 酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL 离子却很高，两者之 间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比， 这一区带便形成了较高的电压剃度， 压着蛋白质分子聚集到一起， 浓缩为一狭窄的区带。 当 样品进入分离胶后，由于胶中pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接 紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小， 在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带 电性和分子大小进行分离。 所以，pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解 决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS 处理、非还原SDS 处理、带有烷 基化作用的还原 SDS 处理。 1）还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT（或 Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象 被解离，电荷被中和，形成SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。 一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮 5min， 再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团， 得到较窄的谱带； 另碘乙酸胺可捕集过量的DTT， 而防止银染时的纹理现象。 100ul 样品缓冲液中 10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS 沸水中煮 3min，未 加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用： 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体， 其凝固的好坏直接关系到电泳成功 与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL 系统，TEMED 与 AP： AP 提供自由基，TEMED 是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠 （SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消