SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量试验报告

SDSSDS－－PAGEPAGE 测定蛋白质相对分子质量测定蛋白质相对分子质量 一、前言一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支 持介质的一种常用电泳技术。 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉 双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用 方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催 化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合， 同时甲叉双 丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应， 分为连续系统和不连续系统两大类， 连续系统电泳体系中缓冲液 pH 值及凝胶浓度相同， 带电颗粒在电场 作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成 分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动 不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清 晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、 浓缩胶及分离 胶所组成。浓缩胶是由 AP 催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为 pH6.7 的 Tris-HCl。分离胶是由AP 催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓 冲液为 pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2 种孔径的凝胶、2 种缓冲体系、3 种 pH 值使不连续体系形成了凝胶 孔径、pH 值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因 素。 SDS 是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子 内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 而强还原剂如巯基乙醇， 二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断 裂。在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS 后，分子被解聚成多肽链， 解聚后的氨基酸侧链和 SDS 结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷 大大超过了蛋白原有的电荷量， 这样就消除了不同分子间的电荷差异 和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统， 与连续缓冲系统相比， 能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀 的样品加在浓缩胶上， 经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭 窄的区带。当样品液和浓缩胶选 TRIS/HCl 缓冲液，电极液选 TRIS/ 甘氨酸。电泳开始后， HCl 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨 酸根离子。 蛋白质带负电荷， 因此一起向正极移动， 其中氯离子最快， 甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过 蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因 而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动， 形成一稳 定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量， 而与所带电荷和分子形状无关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式 : 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够 保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、 蛋白质的形状及其所附 带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 而 SDS-PAGE 仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白 质。该技术最初由shapiro 于 1967 年建立，他们发现在样品介质和 丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS 即十二烷基硫酸钠) 后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小 (可以忽 略电荷因素)。 二、实验目的二、实验目的 1.学习 SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 3.运用 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。 三、实验原理三、实验原理 1.1.电泳电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 在一定的电场强度下， 分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大 小、构型和带电量的大小。 2.PAGE2.PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和引发剂过硫酸铵 (AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为 支持介质的电泳称为 PAGE。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 PAG 机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 Acr 浓 度或 Acr 与 Bis 的比例可以得到不同孔径的凝胶。 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中 缓冲液 pH 值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下， 主要靠电荷和 分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、 分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较 前者佳。 3.SDS-PAGE3.SDS-PAGE基本原理基本原理 SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入 SDS 和含有巯基乙醇的样品 处理液，SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内 和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。 使蛋 白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS 充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。 蛋白质分子结合 SDS 阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它 原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。 蛋 白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。 而与其所带电荷 的性质无关。 当蛋白质的分子量在 17,000～165,000 之间时， 蛋白质-SDS 复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系： lgMW = K - bm 将已知分子量的标准蛋白质在 SDS-PAGE 中的电泳迁移率对分 子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋 白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 四、实验器材和材料试剂四、实验器材和材料试剂 仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50 或 100μl 微量注射器、 玻璃板、水浴锅，染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。 原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白 0.5-1mgml-1 样品溶 解液配制。 可配制成单一蛋白质标准液， 也可配成混合蛋白质标准液。 试剂:(1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH8.9):取 1mol/L盐酸 48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至 100mL； (2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl 缓冲液 PH6.7):取 1mol/L 盐 酸 48mL,Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至 100mL； (3)30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同， 称丙烯酰胺 (Acr) 30g 及 N，N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，溶于重蒸水中，最 后定容至 100ml，过滤后置棕色试剂瓶 中，4 保存； (4)10%浓缩胶