正常小鼠原代骨骼肌细胞培养

PriCells –正常小鼠原代骨骼肌细胞培养 一、实验试剂 1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement 2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO 3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S 4、染色液： 0.4% Trypan Blue 5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit 6、检测试剂：鼠抗人及大鼠desmin一抗，肌球蛋白（myosin）单克隆抗体 二、实验器械 1、培养皿 2、培养瓶 3、直剪和眼科剪 4、眼科镊和止血钳 5、烧杯 6、15ml离心管 三、实验流程 取肌肉于平皿，Hank s洗3次 ↓ 剔除脂肪、结缔组织 ↓ 肌肉标本剪约0.1cm3小块 ↓ 移至离心管，Hank s洗3次 ↓ 静置1min，弃去上层液及漂浮组织 ↓ 0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次 ↓ 生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛 ↓ 离心，1000rmp,10min，弃去上清 ↓ 5/ml 个 105 ×重悬，计数细胞，接种密度以． ↓ 悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h ↓ 转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO 2↓ 4d换液，以后每天换 四、实验操作 1、 新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank s洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块； 2、 将剪碎的肌肉移至离心管，Hank s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织 3、 向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化； 4、 反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min； 5、 弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d换液，以后每天换液1次。 五、细胞鉴定 1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。12h后，细胞开始贴壁，72h后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。当细胞融合80%以上后，开始形成肌管。 2、免疫细胞化学染色1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。 3、免疫细胞化学染色2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋白（myosin）单克隆抗体检测。取含骨骼肌细胞盖玻片常规处理后进行myosin的细胞免疫化学染色，PBS代替一抗做阴性对照。结果判定：以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。 六、注意事项 1、胰酶消化过程中，也可采用15min两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定，一般成年大小鼠采用两步消化效果好，幼鼠一步消化和两步消化差别不大。 2、传代培养代数不要太多，骨骼肌细胞传代能力有限，容易死亡。 3、骨骼肌细胞培养过程中，形态会发生较大变化。 、肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织。4．