2荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的 将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。 其主要组成部件 有三个(图 1．1)：1．识别结合基团(R R)，能选择性地与被分析物结合， 并使传感器所处的化学环境发生改变。 这种结合可以通过配位键，氢 键等作用实现。2．信号报告基团(发色团, F F)，把识别基团与被分析 物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。 信号报告 基团起到了信息传输的作用， 它把分子水平上发生的化学信息转换成 能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。 3． 连接基团(S S)， 将信号报告基团和识别结合基团连接起来， 根据设计的不同连接基团 可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。 连接基团 的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。 信号表达可以是荧光 的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图 1.1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[21] + + SignallingSignalling SpaceSpace subunitsubunit BindingBinding subunitsubunit AnalyteAnalyte OutputOutput signalsignal 图 1.2 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接 起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对 比加入分析物前后荧光强度的变化、 光谱位置的移动或荧光寿命的改 变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中， 必须充 分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成： 考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光 （高荧光量子产率， 有利于提高检测的灵敏性） ， Stokes 位移要大 （可 有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象） ，荧光发射 最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，可避免复杂体系的常位 于短波长区的背景荧光的干扰， 另外由于长波长区发射的荧光能量的 降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命） 。(b) 受 体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、 配位 作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选 择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(c) 荧光超分子受体的组 装： 组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团 通过共价键连接在一起， 要充分考虑到识别基团和荧光基团之间能通 过连接基进行信号传递，对识别对象的识别信息（如荧光的增强或减 弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等）可以及时传递出去。 N N N 1 图 1.3 共价连接型锌离子荧光探针 De Silva 在 1997 年报道的化合物 1[22]是一个典型的共价连接法 设计的荧光探针。它分别以有优良光学性质的蒽作为荧光基团， 以对 Zn2+有特异性识别的基团双( 2-吡啶甲基)氨 (DPA)为识别基团，通过 亚甲基将识别基团和荧光报告基团连接在一起。 通过对比加锌前后荧 光强度的不同实现了对锌离子的检测。 (2) 置换型荧光探针 图 1.4 置换型荧光探针 利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂 和被分析物结合能力的强弱来实现对被分析物的检测。 该类传感器对 识别基团和荧光指示剂的要求都比较高， 既要选择能和识别基团结合 但结合能力又不是特别强的荧光指示剂， 又要设计对被分析物能特异 识别的识别基团。 该类设计方法多用于阴离子传感器的设计。 2002 年，Kim 小组[23]设计了邻苯二酚紫作为荧光指示剂，双锌 配合物为 HPO42-识别基团，并将二者自组装成化合物2，用于中性 条件下水溶液中HPO42-的检测。加入识别客体HPO42-后，由于 HPO42-与双锌配位能力强于邻苯二酚紫，从而把邻苯二酚紫挤开， 使之进入溶液，表现为其原来颜色。在识别过程中，溶液颜色从蓝 色变为黄色，常见的 Ac-、CO32-、NO3-、N3-、ClO4-、S2-、F-、Cl-、 Br-都不影响 HPO42-的检测，表现出较好的选择性。 图 1.5 置换型 HPO42-化学传感器 (3) 化学计量型荧光探针（chemodosimeter） 化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特异 不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行检测 的一类探针[24]。 主要包括两种类型： 一类是目标离子和探针分子发生 化学反应后仍旧通过共价键相连接:另一类是目标离子催化了一个化 学反应（图 1.6）。 图 1.6 化学计量法的两种类型 一般而言，化学计量型荧光探针分子都具有专一性和不可逆性。 尽管这类探针已有不少报道,但由于设计较为困难和反应不够灵敏等 缺陷而进展较为缓慢。 3 3 4 4 图 1.7 氨基酸荧光分子探针 Kim 和 Hong 等[25]设计的识别半胱氨酸及高半胱氨酸的荧光分子 探针 3 3，， 属于第一种类型。他们利用半胱氨酸及高半胱氨酸与醛生 成五元噻唑环或六元噻嗪环的特异反应以及反应前后化合物3 3和4 4荧 光性质的显著差异实现了对半胱氨酸及高半胱氨酸的高选择性检测。 化合物 5 5[26]是较早应用化学反应原理实现检测客体的荧光探 针，属于第二种类型。化合物 5 5 的乙腈溶液中加入汞离子后荧光显著 增强(34 倍)并红移，进一步用质谱检测发现生成了脱硫产物6 6。 5 5 6 6 图 1.8 基于汞脱硫原理的汞离子荧光探针 1.1.2 荧光分子探针的响应机理 目前，荧光分子探针的响应机理主要有以下几种： 光致电子转移 （PET, photo-induced electron transfer） 、分 子内电荷 转移 （ICT, intramolecular charge transfer） 、 荧光共振能量转移 （FRET, fluorescence resonance energy transfer）等。 (1) 光诱导电子转移原理（PET） 光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后， 激发态的电 子给体与电子受体之间发生电子转移的过程。 典型的光致电子转移荧 光探针体系是由具有电子给予能力的识别基团 R R 通过连接基团 S S 和 荧光基团相连组成的功能分子。 一般情况下，荧光分子探针的识别基团是电子给体， 荧光基团是 电子受体，并且通常情况下多采用含有氨基的基团作为识别基团。 具 体 PET 工作过程如下：在识别基团与待测物种结合之前，当荧光基 团受激发， 具有给电子能力的识别基团能够使其处于最高占据轨道的 电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道， 使被光激发的 电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，导致荧光基团的荧光猝 灭。而识别基团与待测物种结合之后， 由于降低了识别基团的给电子 能力，光致电子转移过程被减弱或者不再发生， 荧光基团的荧光发射 得到恢复（如图 1.9） 。 PETPET 荧 光 基团 (Fluorophore) h exc h fluo (linker) 连 接体 识 别基 团 荧