CFX荧光定量PCR仪操作指引Bio-rad

CFX96CFX96 实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR 仪操作流程及注意事项仪操作流程及注意事项 开始运行仪器 打开电脑 打开定量 PCR 仪底座开关 启动 CFX Manager 软件 放置样品 将 PCR 反应体系加入到 0.2ml 低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘 96 孔板，用光学级封膜封好。注 意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 设置程序，运行实验 定量 PCR 软件操作基本步骤为：a. 设置热循环程序文件（Protocol Tab） b.设置反应板文件 （Plate Tab）。 C.点击“Start Run”键，运行程序热循环程序文件（Protocol Tab）设置指南：点击 Edit（编辑）或 Create New（创建新程序）。 反应板设置文件（Plate Tab）设置指南：选择本次实验所要使用的荧光染料种类；单击样品类型； 如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard），点击“Dilution Series”键可设置 其标准品浓度及稀释倍数。 点击“Start Run”键。单击 open lid（打开热盖）或 Close lid（关闭热盖）放置样品；单击 Start Run，保存文件，开始运行程序。 结果分析 PCR 反应结束后，软件会自动计算标准曲线和 Ct 值等。 如需进行表达量分析、等位基因分析等， 在软件窗口选择相应分析功能。 点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单 关闭运行仪器 实验结束后取出反应管，顺序关闭 CFX Manager 软件、定量 PCR 仪电源，关闭电脑。注意！CFX 仪器 上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故 障，危及仪器使用。 整理为 word 格式 CFX ManagerCFX Manager 软件操作快速指南软件操作快速指南 实验操作程序设置图 1 显示实验设置窗口中一个预览的程序。 点击Create NewCreate New，打开程序编辑器创建一个新的程序。点击Select ExistingSelect Existing，通过浏览器加载 一个程序或对其进行编辑。使用 Express Load 下拉菜单直接加载一个程序或对其进行编辑。点击EditEdit SelectedSelected，打开程序编辑器编辑所选程序的各个步骤。点击Start RunStart Run 开始运行当前加载的程序。 程序编辑器程序编辑器可用来创建一个新程序或编辑一个已存在的程序，图 2。 整理为 word 格式 1．在图形或文本模式下选择任何需要编辑的一步（该步骤会用蓝色高亮显示），点击温度或保持时 间进行直接编辑。 2．点击Insert StepInsert Step 在程序中增加一个温度步骤。点击Delete StepDelete Step 在程序中删除选中的步骤。 3．点击Add Plate Read to StepAdd Plate Read to Step，在程序中指 定获取荧光数据的时间。如果当前的高亮显示步骤已经进行了读板设置，则这一选项变为 Remove Plate Read。如果在这一步不想获取数据，则点击Remove Plate ReadRemove Plate Read。 4． 点击 GOTO 步骤的重复次数， 改变程序中的循环次数， 图 2 第 4 步。 点击 GOTO 步骤数可改变 GOTO 循环中所包含的步骤。 增加一个梯度步骤： 1．在程序编辑控制窗口中，点击Insert GradientInsert Gradient，图 2。 2．对梯度中最低和最高温度值进行编辑，在图形模式，文本模式下或出现在文本模式右侧的梯度范 围计算器中直接点击数值进行编辑，图 3。 3．在梯度范围计算器中，对任何一行都可以赋予一个指定的温度。每行的温度都会调整为合适的温 度来满足指定的温度范围。 增加熔解曲线： 1．在程序编辑控制窗口中，点击Insert Melt CurveInsert Melt Curve，图 2。 2．在图形或文本显示模式下，点击温度值来编辑融解曲线范围的最低和最高温度，图 4 第 5 步。 整理为 word 格式 3．点击增量值来编辑数据获取的温度区间。 4．点击保持时间编辑每一个增量温度的保持时间。 整理为 word 格式 CFX ManagerCFX Manager 软件数据分析快速指南软件数据分析快速指南 定量分析数据浏览 扩增图表可以显示实验中每个循环每个孔收集的相对荧光信号曲线。点击位于扩增图表下方的荧光 检查窗，选择需要显示的荧光数据，图 1。在孔选择器中点击孔，行或列来显示所选孔的荧光数据，图 1。 选中的孔是蓝色的，未选中的孔是亮灰色的。若把光标置于荧光信号曲线上，孔选择器中的孔上，数据电 子表格的孔上，或者标准曲线上均可以显示出相应的信息。 数据分析选项 CFX Manager 软件可以自动的扣除从各个孔所得数据的基线。从菜单栏中选 择SettingsSettings，选择BaselineBaseline ThresholdThreshold 可以改变基线范围。软件会自动计算基线的位置。可以点击并拖 动阀值线来手动定位。点击工具栏中 View/Edit PlateView/Edit Plate 按钮来编辑孔的内容，可以临时创建新的分群，从 分析中增加或删掉一些孔。 整理为 word 格式 图表选项可用鼠标右键点击任何图表来复制或保存图像，或选择ChartChart OptionsOptions 来改变轴范围或删 除栅格，图 2。点击工具栏中TraceTrace StylesStyles 按钮，或鼠标右键点击任何图表来设定制定孔的荧光信号曲 线颜色。鼠标左键点击任何图表，向下和拖动光标可以放大图表。孔的分群数据浏览使用工具栏中 Select Well Group下拉菜单来浏览指定孔的分群数据，图 3。软件可以针对每个分群作为独立的实验来处理，每 一个分群可针对自己的设置进行分析，如进行自身标准曲线的分析。 定量数据分析显示选项点击数据分析窗口中Quantitation DataQuantitation Data，浏览数据计算和统计，包括每个 孔的阀值（ CT）和平均值以及复制的标准偏差，图 4。点击任一列的标题进行基于列的行分类。鼠标右键 点击电子表格并选择SortSort 可进行基于多个列的行分类。鼠标左键点击任一列的标题并向左或向右拖动可 以重新排列电子表格中列的顺序。鼠标右键点击电子表格，选择数据输出格式如 text，XML 或 Excel 输出 数据，图 4。从QuantitationQuantitation DataData 下拉菜单中选择PlatePlate，在反应板栅格模式下显示所选荧光的孔数 据。 创建报告显示选项 点击数据分析窗口工具栏中ReportReport 按钮，图 1，打开 Report 窗口，图 5。点击报告选项列表中的检查 窗，使制定信息包含在报告中，这些信息在预览部分中会有所显示，图 5。点击工具栏中FileFile 并选 择Save