3体外诊断试剂如何优化产品工艺和反应体系

一、如何优化产品工艺和反应体系 1.资料调研和原材料质量检验 资料调研，关于检测物质是否已经有成熟的方法，了解该检测物的免疫学知识，临床知识然后确定研究方法。 确定研究方法后，购买具有知名度的公司购买原料包括酶标板，标准品，抗体和酶。同时购买对照试剂盒进 行标准品的检验。酶标板需要对孔间变异系数检验和阳性阴性质比较检验。抗体活性，可以选择 wb 来进行 检验，也可以采用其它方法如琼脂板的方法，抗体抗原形成沉淀。酶的活性检验的同时需要对其纯度检验， 酶的纯度 RZ 值（OD403nm/OD280nm）应大于 3.0。 2.确定产品工艺 一般人用 IgG 抗体浓度选用 1ug/mL，首先确定抗体包被浓度为该浓度。稀释液中确定影响因素如 二价阳离子钙镁锌等浓度一般选用1mM 缓冲液，pbs，tris，hepes，等，一般是在中性比较多 封阻剂脱脂牛奶，BSA，牛血清，酪蛋白，明胶（明胶和酪蛋白较难溶解，脱脂奶粉不易长期存储） 阻断剂病人血清/血浆中的内源性异嗜性抗体，可结合其他种属的免疫球蛋白，可以用阻断剂排除非特异性 干扰，包含两类 HAMA 类阻断剂Human Anti-Mouse Antibodies和真正的异嗜性抗体阻断剂HBR 离子浓度可以添加各种盐分增加特异性 3.包被和标记相关优化条件在其它文件不在赘述 4.需要优化的条件较多包括加样的体积；孵育温度，时间；产品的稳定型所带来的各种主要原料的保存， 有机化学试剂，生物辅料的选择；经济效益；临床条件等等根据诊断试剂盒评价指标的指导下，应用免疫化 学知识来更改条件保证产品质量和相关参数测定。 二、改性聚苯乙烯微球对蛋白质的吸附与解吸特性 影响因素结论原理 PS-PEG对2 h 平衡吸附的90以聚苯乙烯微球，有很强的疏水性，生物相容性不好，强烈的疏水 BSA 的吸附上， 3,h 吸附平衡吸附作用使蛋白质构象改变， 导致变性， 并且吸附后不易脱附， 载体难以重复使用， 因此对载体进行亲水性修饰 pH 对BSApH 在 5 附近吸附量最大 吸附的影响 BSA 接近等电点，呈电中性，静电排斥减少，疏水作用力为最大 作用力 NaCl 浓度对盐浓度的增加，微球对用盐析的办法调节体系的疏水性， 改变微球、 BSA 和体系之间 BSA 吸附BSA的 吸 附 量 增 多疏水作用力的平衡关系。盐析作用暴露疏水链，疏水作用力增加， 1mg/mL同时蛋白质聚集 1.苯乙烯微球，不仅生物相容性不好， 而且强烈的疏水吸附作用使蛋白质构象改变， 导致变性， 并且吸附 后不易脱附， 载体难以重复使用， 因此对载体进行亲水性修饰 三、聚苯乙烯对蛋白质的吸附特征及其在固相免疫测定中的意义 影响因素结论原理 不同蛋白质Ig M I g G I g G Z 蛋白质是 通过疏水键来连结聚苯乙烯的 。在连接过程中其净电 对聚苯乙烯BS A 乳 白蛋 白 的亲和力 包被聚苯乙10mg/mL与洗去蛋白与蛋白连接的多层化部份中的蛋白 ,保 留了结合在聚 荷作用甚微 烯后洗涤对200mg/MlBSA 溶液包被苯乙烯一蛋白中的那部分蛋白。而这部分蛋白的量是较为值定 吸附蛋白质聚苯乙烯 ,经过充分洗涤， 的。 的影响苯乙烯表面的BSA 吸附量 仍大体一致 四、基于聚苯乙烯微珠敏感元件的表面改性、抗体分子定向固定化及催化信号放大分析研究 原理方法措施 传统抗体氨基固定的方法（不定位） 不处理抗体。利用蛋白质赖氨酸的氨基固定抗体时，产生空间随 机固定及多点固定的问题，固定化蛋白质空间构象发生变化，蛋 白质部分或全部失活 提高检测灵生物分子定向固定化技术 敏度， 降低检 测下限。 降低 背景、 增强信 号，其信噪比 的提高 蛋白 A 固定化（定位） 蛋白 A 与 IgG 的 Fc 端特异性结合， 让蛋白 A 结合抗体 Fc 端的活 性位点远离固相载体，提高抗体固定化效率。 巯基固定化定位 巯基可以与溴乙酸、马来酰亚胺活化的载体形成稳定的共价键。 巯基乙胺还原后可以暴露出 Fc 端的巯基，以用活化生物素标记 Fab 段巯基，使之与链酶亲和素修饰的载体表面相结合，来完成 抗体定位固定 糖基固定化（定位） FC 端含有糖残基，当用氧化剂如高碘酸钠氧化为醛基后，可以与 表面带有酰肼或氨基末端基团的载体反应，使抗体定向固定在载 体表面。 非特异性引加入封闭剂 起的高背景 抑制 一蛋白质封闭剂牛血清白蛋白，脱脂奶粉等 牛血清白蛋白制备时可能引入的免疫球蛋白Ig奶粉中会含有交叉 反映蛋白质等 二聚合物封闭剂聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮 1.聚合物溶液是一个均相体系，不含有潜在的干扰蛋白 2.聚合物溶液很稳定合物试剂很便宜 3.本身有和聚苯乙烯等聚合物载体类似的疏水性，可以通过疏水 作用结合到聚合物载体表面，占据BSA 等的吸附位点 4.聚乙烯醇等除了具有一定疏水性外，也具有亲水性，在封闭完 成后，载体表面会呈现～定的亲水性，这可以有效地抑制后续实 验中的非特异性吸附 聚乙烯醇 PVA，聚乙烯吡咯烷酮 PVP、聚蔗糖 可移除膜封闭技术白质特异性结合后，在该上层磷脂膜表面产生的非特异性吸附将 同双层磷脂膜一起被洗去，从而达到消除非特异性吸附影响的目 的 表面改性构建抗蛋白吸附聚乙二醇类PEG 表面1.它最重要的性质就是强极化性质以及由此带来的亲水性与水溶 性时 2.PEG 在广泛 pH 范围内均为电中性，这种性质可以阻断基质与 蛋白质之间的静电场相互作用。 3.PEG 可以提供较大的空间位阻，有利于将产生非特异性吸附的 物质阻隔在距离基质表面较远的位置，进一步控制非特异性吸附 的发生聚醚类物质 4.容易迅速被氧化，尤其是在有氧和过渡金属存在的条件下，将 聚乙二醇暴露在 45℃空气中，一周就 会降解；在 20。C 的空气中，一个月就会降解 两性离子聚合物类 磷酸胆碱类，硫代甜菜碱类以及羧基甜菜碱类聚合物 1.超亲水性阴、阳离子基团，强烈的离子溶剂化作用使其形成超 强的离子水化层，具有较强的热稳定性、化学稳定、血液相容、 生物相容以及抗生物污染等优良性能 2.其抗非特异性污染的能力与 PEG 相比有过之而无不及，更难能 可贵的是，当与药物分子结合时，它不会 像 PEG 那样由于空间位阻及竞争性相互作用而降低生物活性， 反 而会将水聚集到聚合物材料表面，为底物与蛋白质的相互作用提 供极疏水的环境，达到促进两者相互作用的目的