药物活性筛选试验

实验计划实验计划 实验目的实验目的采用 HEK293/α 1D-AR/Gα 16 细胞模型，通过钙流实验评价关黄柏的四个血中 移行成分小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮及木兰碱对α 1D 型肾上腺素能受体的阻滞作用，表征 成分的抗前列腺炎潜在活性； 在 22RV1人前列腺癌细胞上， 通过 MTT 及相关分子生物学分 析评价以上四种血中移行成分的治疗前列腺癌活性。 第一章第一章 关黄柏血中移行成分抗前列腺炎活性评价关黄柏血中移行成分抗前列腺炎活性评价 1 1 实验材料实验材料 1.11.1 仪器与试剂仪器与试剂 1.1.11.1.1 实验仪器实验仪器 CO2 培养箱 紫外消毒柜 倒置荧光显微镜倒置荧光显微镜 倒置显微镜 超微量分光光度计 离心机 干燥箱 荧光读板仪荧光读板仪 低温离心机 生物安全柜 电子分析天平 超纯水机 离心机（小） 电泳仪 电泳成像仪 荧光 PCR 仪 梯度 PCR 仪 磁力搅拌器 SANYO 三洋 泰州安康 OLYMPUSOLYMPUS OLYMPUS 元仪 卢湘仪 上海一恒 PerkinElmerPerkinElmer Hettich HDL 梅特勒-托利多 优普 Thermo Bio-Rad Bio-Rad Bio-Rad Bio-Rad IKA 立式蒸汽压力灭菌器 水浴锅 流式细胞仪 1.1.21.1.2 实验材料实验材料 上海博讯 IKA 默克密理博 HEK293/α 1D-AR/Gα 16稳转细胞系， 22RV1人前列腺癌细胞 （ATCC） ，， ABT-594ABT-594和和RJR2403RJR2403 阳性化合物（肾上腺素、咖啡因）阳性化合物（肾上腺素、咖啡因），，96-96-孔黑边透明底孔黑边透明底GreinerGreiner plateplate（Clear/Clear Bottom） ,Milliporeviacount reagent， DMEM高糖培养液 （Applichem， Germany） ,HBSS Hyclone, USA,台盼蓝 （Sigma， USA） ， RPIM-1640HyClone,FBS,Antibiotics， DMSO， Trypsin-EDTA， HEPES，MTT,Fluo-4 AM免洗钙流检测试剂盒，乙醇其它试剂均为分析纯级。 2 2 方法方法 2.12.1 细胞株培养细胞株培养 细胞的复苏培养 从-80℃中取出冻存管,立即投入 37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液 （37℃预热， 8～10 倍体积） 离心管内,稍微吹打混匀,然后 1000rpm 5min,去除上清,加入适量 培养液,吹打成细胞悬液, 以 1105/mL 密度接种于 25cm2 培养瓶内，在 37℃、5％CO2 及饱 和湿度下培养于含有 10FBS 的 DMEM（High glucose）培养液中，同时加入 400 μ g/mL G418。消化细胞使用含 0.05EDTA的 Trypsin溶液。 2.22.2 细胞的传代细胞的传代 HEK293/α 1D-AR/Gα 16 细胞 48h 换液 1 次，细胞长至 60～70融合时，用 0.25胰酶消 化 1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可 用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合 液，传代扩增细胞。并冻存细胞备用，冻存细胞使用含 10DMSO 或甘油、10～20小牛 血清的冻存培养液。 2.32.3 细胞形态的观察细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。 2.42.4 细胞的计数细胞的计数 常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用milliporeviacount按 比例重悬并吹打制成细胞悬液。预热guava 流式细胞仪，进行流式细胞仪的细胞计数分析。 2.52.5 细胞的贴壁率细胞的贴壁率 指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12 个 25cm2 培养 瓶中，每两小时随机取出 3 瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已 贴壁细胞，取其平均值，按照公式贴壁率已贴壁细胞数/接种细胞数 100％，计算 贴壁率。 2.62.6 生长曲线生长曲线 细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法， 也是判定细胞活力的重要指标， 是培养细 胞生物学特性的基本参数之一。 一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁， 随后度过长 短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。 在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入 平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化， 典型的生长曲线可 分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4 个部分。 以存活细胞数万/mL对培养时间h 或 d作图，即得生长曲线。取指数生长期的细胞用胰酶 消化制成单细胞悬液，以 1104/孔接种于 24 孔板，每孔加入 1mL 培养基。每天随机取 3 孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。 或采用台盼蓝计数法 1取不同时间段生长的原代小鼠肝细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数 2根据细胞计数结果， 以单位细胞数细胞数/mL为纵坐标， 以时间为横坐标绘制生长曲线。 MTT 检测法 （1）细胞接种在 96 孔板上，200ul/孔，培养基代替细胞悬液做为空白对照。 （2）加入 0.1 mL MTT于 37℃孵育 4 h。使 MTT 还原为蓝紫色甲赞结晶。 （3）加入150ul/孔的 DMSO,摇床上低速震荡 15min,使蓝色的结晶充分溶解后，在酶标仪上 在 OD 值 490nm 处检测 （4）计算细胞成活率，绘制细胞生长曲线。 2.72.7 细胞形态观察并记录细胞形态观察并记录 利用倒置相差显微镜观察生长过程中细胞的形态，并拍照记录。 2.82.8 钙流实验钙流实验 配体门控离子通道受体是继Ｇ蛋白偶联受体和核激素受体家族之后的又一重要的受体靶标。 建立基于配体门控离子通道受体介导的钙流变化的药物筛选模型， 将细胞与Ｃａ２＋敏感的 荧光探针（Ｆｌｕｏ－４）共同孵育，使用阳性化合物（ＡＢＴ－５９４）来激动Ｆｌｕｏ －４标记细胞， 通过加入被测化合物后荧光读板仪检测到的钙流变化， 观察被筛选化合物激 动或拮抗钙流反应的能力，筛选出对α1D-AR 起拮抗作用的药物 2.8.1 钙流反应缓冲液配制 HEPES 10 mmol/L， NaCl 5 mmol/L， KCl 5 mmol/L， CaCl22 mmol/L,N-methyl-D-glucamine 140 mmol/L，glucose 10 mmol/L，室温下调 pH 值到 7.4。 2.8.2 细胞内钙流的检测方法 待细胞融合度达70-90时，收集于直径10 cm 的细胞培养皿中培养的HEK293/α 1D-AR/Gα 16 细胞， 加入 Fluo-4 5 μ mol/L 和