细胞因子生物学活性检测

细胞因子生物学活性检测 细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。由于许多细胞因子cDNA 克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、 生物学功能的鉴定提供必要条件。 目前检 测细胞因子水平主要包括两类方法 一是生物学活性的检测， 这类方法是利用细胞因子某一 特定的生物学作用所设计的检测方法，如IL-2 维持活化 T 细胞的增殖，IFN 能保护病毒对 正常细胞的感染，TNF-α 选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的检测， 常用酶联免疫吸附试验ELISA，如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单克隆抗 体的双抗体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可同时进行检测。 一、白细胞介素 1IK-1生物学活性测定 白细胞介素 1 是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1 不仅对多种免 疫活性细胞有重要的调节功能， 而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。 目前 对 IL-1 产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。 ConA 刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1 生物学活性 一原理 小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1 受体，在有 IL-1 同时存在的条件下，IL-1 可 协同丝裂原促 T 细胞的增殖作用。根据加入IL-1 后增殖水平３H-TdR 掺入率的增加可计 算出样品中 IL-1 的活性单位，或计算出刺激指数。 二操作步骤 取 6～8 周龄 C57BL16 小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺 置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液 调整细胞数为 1.510７／ml ↓ 细胞悬液内加入 ConA，使终浓度为 3μ g／ml，在 96 孔 培养板中加 100μ l1.510６细胞 ↓ 加入不同稀释度待测样品和IL-1 标准品 100μ l／孔ConA 终浓度为 1.5μ g／ml ↓37℃ CO２孵箱 66h 每孔加３H-TdR 0.5μ ci ↓37℃ CO孵箱 6h 多头细胞收集仪收获于9999 型玻璃纤维纸上 ↓ 烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β 计数 计算 1.从 IL-1 标准曲线上测得 IL-1 的活性单位 2.也可用刺激指数SI表示 实验组 cpm SI＝──────100％ 对照组 cpm 三试剂和器材 1. 10％ FCS RPMI1640，96 孔培养板，CO孵箱 2.标准 IL-1，ConA 3.３H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯 4.9999 型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪 5.β 液闪计数仪 四注意事项 1.不同品系小鼠对IL-1 的反应性有差异，据国内资料报道以C57BL 为好。 2.不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA 反应性不一， 一般选用 6～8 周龄， 小于 5 周或大于 10 周龄小鼠胸腺细胞对 ConA 反应不稳定。 3.ConA 促丝裂原作用要进行预试，一般采用亚适剂量。 应用 EL-4 CTLL 检测 IL-1 生物学活性 IL-1 是一种十分重要的免疫调节因子，同时也是一种可引起发热和导致多种病理损伤 的重要的内源性致热原和炎症介质。目前IL-1 检测方法有多种，主要包括小鼠胸腺细胞 法，黑素瘤细胞增殖抑制法，纤维母细胞法、T 淋巴细胞系法以及 EBV 转化 B 细胞法等。 ㈠ 原理 小鼠胸腺瘤细胞系 EL4 的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1 受体， 在 IL-1 诱导下产生高水平的 IL-2，通过用IL-2 依赖株 CTLL-2 检测 IL-2 的生物学活性，从而反映 检测样品中 IL-1 的水平。 ㈡ 操作步骤 1. 用 EL４细胞两步法检测 IL-1 活性 收集处于对数生长期的EL４细胞 ↓ 洗涤后，用 1％FCS RPMI1640 重悬细胞，并 调整细胞浓度 210６/ml， ↓ 加处 96 孔板中，100μ l/孔 ↓ 加入不同稀释度的 IL-1α 或 IL-1β ，100μ l/孔， 同时设 1％FCS RPMI 1640 对照 ↓ 5％CO,37℃培养 18～24 小时 ↓ 按终稀释度为 1∶10～20 转入另一块 96 孔板中 ↓ 用 CTLL-2 检测 IL-2 活性、检测方法见“IL-2 检测“ 2. 用 EL4 细胞一步法检测 IL-1 活性 用 5％FCS RPMI 1640 调整 EL4 细胞浓度至 210５/ml，CTTL-2 浓度至 410５/ml ↓ 加入 96 孔板中，两种细胞各加50μ l/孔 ↓ 加入不同稀释度的 IL-1 或待测样品，同 时设 EL４和 CTLL-2 细胞对照 ↓ 置 5％CO２,37℃培养 24～28 小时后加入 ３H-TdR,0.5μ ci/50μ l/孔,继续培养 6～8 小时 ↓ 收集样品，β 计数 ㈢ 试剂和器材 1. EL４细胞 2. CTLL-2 细胞 3. 标准 rIL-1。 4. ３H-TdR、POPOP、PPO、二甲苯。 5. 玻璃纤维滤纸，细胞收集仪。 6. β 计数仪 7. 96 孔板，无菌吸管，滴管、试管及加样器头。 8. FCS,RPMI 1640,CO２培养箱等。 ㈣ 注意事项 1. 在一步法检测 IL-1 时， 其 EL４细胞浓度不宜超过 110４/孔， 血清终浓度应＜5％。 2. 在二步法检测 IL-1 时，其 EL４细胞浓度在 210５/孔时，犉 d 转移上清稀释度不 宜低于 1∶8,其诱导时间应 12～24 小时间为佳。诱导血清浓度应≤1％。 3. 在检测经诱导的上清中IL-1 时，应避免使用 A23187，TPA 和 ConA 等较强的能诱导 EL４细胞产生 IL-2 的诱导剂来刺激 IL-1 的产生。 二、白细胞介素 2IL-2的生物学活性测定 一原理 IL-2 主要由活化 T 细胞产生，又为 T 细胞增殖所必需，故称 T 细胞生长因子（ T Cell Growth factor, TCGF ）。IL-2 产生的水平反映 T 细胞的功能，牪;仅是免疫调节重要的研 究对象，而且与临床多种疾病密切相关，CTLL 是 C57BL／6 来源的。犘鼠杀伤性 T 淋巴细 胞细胞系，由Gills 1977 年建立，只有在IL-2 存在的培养基中才能生长。因此可作为指示 细胞来测定待检样品中 IL-2 的水平。 除 CTLL 外， 丝裂原活化的 T 淋巴母细胞亦可作为检测 IL-2 活性的指示细胞。 二方法 可根据实验室条件，选用３H-TdR 掺入法和 MTT 法 1.３H-TdR 掺入法 IL-2 依赖的 CTLL 用 10％FCSRPMI1640 洗涤 2 次，每次 1000rpm, 5min, 除去原培养液中的 IL-2 ↓ 调整活细胞数 110５／ml ↓ 96 孔平底培养板中每孔加100μ l CTLL 悬液110４／孔 ↓ 加入不同稀释度标准 IL-2 和待测样品 ↓ 37℃CO孵箱，培养 18～24h ↓ 每孔加３H-TdR 0.5μ ci／50μ l ↓ 4-6h 用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上 ↓ 干燥后，移入液闪瓶中，加入1ml 闪烁液， 于液闪仪中测 β 射线的 cpm 值