沉降菌测试方法

沉降菌测试方法沉降菌测试方法 1、把ф90mm15mm 硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热 至 180℃后，干烤 2 小时。 2、 取 X 克培养基放入 X 克蒸馏水， 放入高压消毒锅中加热溶化， 冷至 45℃ 时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。 3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于 33℃恒温培养箱中培养 48 小时， 假设培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。制备好培养皿宜在 28℃环境 中保存。 4、采样时，一般在100 级层流罩中放置 3 个培养皿，在 100000 级，10000 级按面积大小一般放 2 个培养皿。打开培养皿盖，使培养基外表暴露0.5 小时， 再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱 33℃1.5m 左右。 5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用510 倍放大镜检 查是否遗漏，假设培养皿上有 2 个或 2 个以上菌落重叠，分辨时仍以 2 个或 2 个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉 淀物区别。 6、沉降菌测试前， 被测洁净室已消毒。 被测洁净室温湿度须到达规定要求， 静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内，测试状态有静态和动态两 种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。 7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试 人员不得多于 2 人。测试时间对单向流 100 级净化房间及层流工作台，测试应 在净化空调系统正常运行不少于 10min 后开始，对非单向流，100000 级以上净 化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min 后开始。 8、平均菌落数计算M 1M2M3 平均菌落数 M 1  M 2  Mn . n n培养皿总数 M11 号培养皿菌落数 M22 号培养皿菌落数 Mnn 号培养皿菌落数 用平均菌落数判断洁净空气中微生物。洁净室内平均菌落数必须低于所选 定的评定标准， 〔100 级≤1 个；10000 级≤3 个；100000 级≤10 个〕 。假设某洁 净室内平均菌落数超过标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次， 测试结果均须合格。 人员进出洁净生产区的一般程序 进 出 单旁门 向通 换 鞋 脱 外 套 洗 手 穿工 洁作 净服 手 消 毒 气或吹 闸空淋 室气室 洁 净 生 产 区 人员进出无菌操作洁净生产区程序 进 出 换 鞋 脱 外 套 脱 内 衣 洗 脸 手 腕 穿 无 菌 内 衣 手 消 毒 穿 无 菌 外 衣 换 无 菌 鞋 手 消 毒 气气 闸吹 室淋 或室 空 无洁 菌净 操生 作产 区 无菌医疗器具洁净室环境要求及监测 监测项目技术指标监测方法监测频次 100 级10000 级100000 级300000 级 温度〔℃〕18℃28℃1 次/班 相对湿度45651 次/班 水平层流 风速 m/s≥0.4JC 垂直层流1 次/月 ≥ 换气次数≥20≥15≥12 1次/月 静压差 Pa不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间≥5 洁净室与室外大气≥10 1次/月 沉降菌数≤1≤3≤10≤15 GB/T16294-1996 1次/周 附录 C〔资料性附录〕洁净室〔区〕沉降菌技术要求 洁净室〔区〕沉降菌技术要求 澳大利亚 TGA CGMP 2002 年 8 月 16 日 欧盟 EUCGMP 附录 l 2008 年 2 月 美国 FDA CGMP 〔2004 年 9 月〕 药品生产质量管理 标准 〔1998 修订〕 洁净度 级别 φ90mm CFU/4ha φ90mm CFU/4ha A 级 B 级 C 级 D 级 ＜1 ≤5 ≤50 ≤100 φ90mm CFU/4ha ＜1 ≤3〔1000 级〕 ≤5 ≤50 ≤1 - ≤3 ≤10 100 - 10000 100000 A 级 B 级 C 级 D 级 ＜1 ≤5 ≤50 ≤100 为培养皿暴露时间不超过4h，以平均菌落数表示。 无菌检查法试验步骤无菌检查法试验步骤 无菌检查在洁净度 100 级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无 菌操作，防止微生物污染。 1、器具灭菌培养皿假设干个〔报纸所好〕 、试管、剪刀、镊子等装入盒 中置电热干燥箱内 180℃，2 小时。 2、硫乙醇酸盐流体培养基〔细菌〕 ，根据试验实际用量取假设干培养基和 蒸馏水，煮沸，摇匀，分装至适宜的容器中，瓶塞封口，灭菌。硫乙醇酸盐流 体培养基置 33℃培养 48 小时，应无菌生长。 改进马丁培养基〔真菌〕 ，根据试验实际用量取假设干培养基和蒸馏水，煮 沸，摇匀，分装，灭菌。改进马丁培养基置 24℃培养 72 小时，应无菌生长。 营养琼脂根据实际用量按一皿装 15ml，分装几个皿来计算，灭菌。 0.9氯化钠分装至 7 支试管，封口，灭菌。 3、把金黄色葡萄球菌用接种环刮一下，放入 0.9氯化钠试管中摇匀，作 10 倍系列稀释至 10 -7， 然后从 10-5、 10-6、 10-7 试管各抽取 1ml， 分别放入标号 5、 6、7培养皿里，倒入营养琼脂摇匀， 〔营养琼脂不能太烫，以不烫手为准〕待 营养琼脂冷却后倒置放入 33℃培养箱中培养 48 小时，48 小时中取出观察计数， 根据菌落数小于 100cfu 来决定用几号。 4、操作时，应用适当的消毒液对供试品外表或外包装擦拭消毒后，以无菌 方法取内容物。取供试品 3 只接种于足以浸没供试品的适量培养基中。一只瓣 膜接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，轻轻摇动，使瓣膜与培养基混合， 1 支试管 接种金黄色葡萄球菌对照用菌液 1ml,作阳性对照，1 支作空白对照。另取 2 只 瓣膜接种于改进马丁培养基中， 2 支试管作空白对照。硫乙醇酸盐流体培养基置 33℃培养，改进马丁置 24℃培养阳性对照管培养 48 小时后应有菌生长。 5、结果判断在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。培养14 天后， 假设供试品管匀澄清，判供试品符合规定；假设供试品管中任何一管显浑浊并 有菌生长，判供试品不符合规定。 细菌内毒素试验步骤细菌内毒素试验步骤 1、准备工作 移液管0.1ml1 支，1ml10 支 试管10ml4 支，试管架 2 个〔大小〕 烧杯 40ml2 个，锥形瓶 2 个 试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置电热干 燥箱内 180℃干烤至少 2 小时。 细菌内毒素检查水 10ml4 支 细菌内毒素工作标准品 1 支，每安瓿含内毒素 10EU 8 支 同一批号 3 支瓣膜 浸提介质细菌内毒素检查水 浸提介质体积计算公式V8.6〔ml〕 L 325.8〔ml〕 把细菌内毒素检查水 4 支外表擦净打开，倒入烧杯中，用移液管取 25.8ml 倒入装 3 只瓣膜烧杯中，用锡纸封口，放进提前打开升温至 37℃恒温培养箱中， 培养 1.5 小时。供试液贮存应不超过 2 小时。 注V-浸提介质体积，单位为毫升〔ml〕 L-产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每毫升〔EV/ml〕