生物样品的制备与提取

第二章第二章生物样品的制备生物样品的制备 2. 1生物分析化学分析对象的复杂性 生物样品往往是一种具有高度复杂性的体系，这种复杂性表现在组成、含量、动力学范 围、时空依存性等各个方面，这使得生物样品的处理有很大的难度。因此，与经典分析化学 的样品制备相比，生物分析化学的样品制备有以下特点 （1）生物样品的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。如人类血浆蛋白质 组学的阶段性研究结果表明，正常人血浆中的蛋白质至 2005 年时已鉴定了 3020 种。有的生 物分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种 适合各种生物大分子分离制备的标准方法是很困难的。 （2）许多生物分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万 分之一。分离纯化的步骤繁多，流程长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达 到所需纯度的要求。 （3）生物分子往往有很宽的动力学浓度范围。如不同的蛋白质在细胞内的浓度分布范围相 差 106～1010倍，而同一种蛋白质在不同的生理或病理状态下浓度相差有时也很大。 （4）许多生物分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其 失活，就是生物分子提取制备最困难之处。过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身 的自溶等都会使生物大分子变性而失活。 （5）生物分子的分离和制备几乎都是在溶液中进行的，很难准确估计和判断温度、 pH 值、 离子强度等各种参数对溶液中各种成分的综合影响， 因而实验结果常常带有很大的经验成份， 实验的重复性较差，分析仪器、分析方法学、乃至个人的实验技术水平和经验对实验结果会 有较大的影响。 制备生物分子的基本原则是以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得尽可能多的目 标产品。通常包括以下步骤①确定要制备的生物分子的目的和要求；②通过文献调研和预 备性实验，掌握目标产物的物理、化学以及生物学性质；③生物材料的破碎和预处理；④分 离纯化方案的选择和探索；⑤选择相应的、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备物的均 一性（即纯度）的方法；⑥产物的浓缩、干燥和保存。 在进行样品处理时，需要考虑的生物分子的物理、化学及生物学性质主要有①在水和 各种有机溶剂中的溶解性； ②在不同温度、 pH 值和各种缓冲液中的稳定性； ③固态时对温度、 含水量和冻干时的稳定性；④各种物理性质如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、等 电点、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等；⑤其 它化学性质，如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性；⑥对其他生物 分子的特殊亲和力；⑦在细胞内的定位等。 生物大分子和生物小分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间在物理、化学 及生物特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其 它分子的亲和性等。各种方法的基本原理基本上可以归纳为两个方面一是利用混合物中几 个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结 晶等；二是将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分 配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。目前纯化蛋白质等生物大 21 分子的关键技术是电泳、色谱和高速与超速离心。由于生物大分子不能加热熔化和汽化，因 而所能分配的物相只限于固相和液相，在此两相之间交替进行分离纯化。在实际工作中往往 要综合运用多种方法，才能制备出高纯度的生物大分子。 制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够的，必须同时采用2～3 种不同的纯度鉴定法才能确定。如蛋白质和酶制成品纯度的鉴定最常用的方法是 SDS－聚 丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，如能再用高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE） 进行联合鉴定则更为理想，必要时再做N－末端氨基酸残基的分析鉴定。 核酸的纯度鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，但最方便的还是紫外 吸收法，即测定样品在 pH 7.0 时 260nm 与 280nm 的吸光度（A260 和 A280） ，从 A260/A280 的比值即可判断核酸样品的纯度。 2. 2生物材料的选择 生物材料来源于动物、植物和微生物及其代谢产物。应尽可能选择选择含量高、来源丰 富、制备工艺简单、成本低的生物材料，但往往这几方面的要求不能同时具备，含量丰富但 来源困难，或含量来源较理想，但材料的分离纯化方法繁琐，流程很长，反倒不如含量低些 但易于获得纯品的材料，由此可见，必须根据具体情况，抓住主要矛盾决定取舍。植物材料 的选材应注意季节性、地理位置和生长环境等。动物材料的选材要注意其年龄、性别、营养 状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分 子的提取分离。微生物材料的选材要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微 生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。 2. 3激光捕获显微切割技术 激光捕获显微切割技术（laser-capture microdissection，LCM）是在显微状态或显微镜直 视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等） 进行切割、分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的显微分离收集技术。 2. 3. 12. 3. 1LCMLCM 的特点的特点 （1）LCM 可以从任何组织中快速、精准地分离出纯的特异细胞及细胞群。每次粘附的直 径在 7.5～30m 可调，既能分离任何形状的单细胞，又能分离大面积组织。因此利用显微切 割技术可以分离收集到像核仁和包涵体及染色体特异区带这样细微的对象。 （2）利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所 研究对象的历史背景明确。例如何杰金氏淋巴瘤中瘤组织成分多样，特征性的瘤细胞R-S 细 胞及其变异型占细胞成分的 2左右，且呈散在性分布,如果常规地用组织匀浆的方式从组织 中提取蛋白质或核酸，则既包含了来自瘤细胞的成分，又包含了来自淋巴细胞、浆细胞、中 性粒细胞、嗜酸性粒细胞、组织细胞等多种非瘤细胞的成分，这样所提的蛋白质或核酸来自 何种细胞并不清楚，而如果用显微切割技术则可以选择我们需要的细胞，以使研究对象的历 史背景明确。 （3）显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性。虽然流式细胞技术也是一种强 有力的同质细胞分离技术，但是它只能处理悬浮液中的细胞，不可能用于各种处于固态的组 22 织中的同质细胞的分离；而且，流式细胞技术需要各种特殊的标记物才能完成分离。因此， 可以认为，LCM 是对流式细胞技术的一种重要的完善和补充。由于LCM 的取材具有高度的 均匀性，因此与从其它制备来源的样品细胞所得到的研究结果相比，其获取的数据更为精确 和具有代表性。 （4）LCM 适用于 HE 染色、免疫组化、荧光标记等多种染色方式，可以与多种分子生物 学、 免疫学及病理学技术结合使用。 LCM 分离的特异细胞或组织可以进行测序、 PCR、 QPCR、 生物芯片、质谱、二维凝胶电泳等分析。 因此，在蛋白质组学、基因