目的基因到工程菌的构建

目的基因到工程菌的构建目的基因到工程菌的构建 1 1 基因工程的诞生基因工程的诞生 1972 年，美国斯坦福大学的学者首先在体外进行了DNA 改造的研究， 他们把 SV40（一种猴病毒）的 DNA 分别切割，又将两者连接在一起，成 功构建了第一个体外重组的人工 DNA 分子。 1973 年， Cohen 等人首次在体 外将重组的 DNA 分子导入大肠杆菌中， 成功地进行了无性繁殖， 从而完成 了 DNA 体外重组和扩增的全过程。在这个的基础上，基因工程诞生了。 SV40SV40 病毒病毒 第一个重组体的构建第一个重组体的构建 1.1 基因工程技术的三大理论基础 一是 20 世纪 40 年代 Avery 等人通过肺炎球菌的转化实验证明了生物 的遗传物质是 DNA， 而且证明了通过 DNA 可以把一个细菌的性状转移给另 一个细菌。二是 20 世纪 50 年代 Watson 和 Crick 发现了 DNA 分子的双螺 旋结构及 DNA 的半保留复制机理。 三是 20 世纪 60 年代关于遗传信息中心 法则的确立，即生物体中遗传信息是按 DNA→RNA→蛋白质的方向进行传 递的。 1.2 基因工程技术的三大技术基础 三大基本技术问题 一是如何从生物体庞大的双链 DNA 分子中将所需 的基因片段切割下来； 二是如何将切割下来的 DNA 片段进行繁殖扩增； 三 是如何将所获得的基因片段重新连接。20 世纪 70 年代，由 Smith 等人发 现的核酸限制性内切酶、 DNA 连接酶和可以作为基因工程载体的细菌质粒 的发现，解决了上述三大问题。 限制性核酸内切酶 限制性内切酶不切割自身 DNA 是因为原核生物中不存在酶的识别序列或 识别序列已经被修饰。 DNA 连接酶 作用实质将具有末端碱基互补的 2 个 DNA 片段连接在一起，形成重 组 DNA 分子，其起作用时不需要模板。 基因工程的载体-质粒 基因载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进 行表达。也就是说，离开染色体的外源 DNA 不能复制，而而插入复制子 DNA 的外源 DNA 可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制， 这种复制子 是外源基因的载体。此外，为满足其使命，还必须具备如下一些特性① 能在宿主细胞内进行独立和稳定的 DNA 自我复制， 在其 DNA 插入外源基因 后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性。 ②易于从宿主细胞中分离，并 进行纯化。③载体 DNA 序列中有适当的限制性内切酶位点，并位于 DNA 复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源 DNA，但不影响载体自身 DNA 的复制。某些病毒载体在外源 DNA 插入后变成缺损性病毒株，只能在 有辅助存在时才能进行正常增殖。 ④具有能够观察的表型特征 （有报告基 因） ，在插入外源 DNA 后，这些特征可以作为重组 DNA 选择标志。 1.3 基因工程的基本过程 1.4 基因工程的应用 2 2 目的基因的获取目的基因的获取 基因工程订是通过人工方法分离、 改造、 扩增并表达生物的特定基因， 从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。 通常我们把插入 到载体内那个特定的片段基因称为“外源基因” ，而将那些已被或者准备 要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段称为“目的基因” 。 来源于真核细胞的产生基因工程药物的基因是不能直接进行分离的。 真核细胞中单拷贝基因只是染色体 DNA 中很小的一部分， 为其 10-5-10-7， 即使多拷贝基因也只有其 10-5， 因此从染色体中直接分离纯化目的基因极 为困难。另外，真核基因内一般都有内含子， 如果以原核细胞作为表达系 统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA 的转录后加工系统， 真核基因转录的 mRNA 也不能加工、拼接成为成熟的 mRNA，因此不能直接 克隆真核基因，必须采用特殊方法分离目的基因。 目的基因的获取大致可以分为三类一是利用PCR 技术甚至化学合成 法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；二是构建感兴趣的生物 个体的基因组文库或者 cDNA 文库，即将某生物体的全基因组分段克隆， 然后建立合适的筛选模型从文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 三是近 年来发展的利用基因差异表达获取目的基因的技术。 直接分离法（鸟枪法） 直接从生物细胞基因组中获取目的基因最常用的方法是 “鸟枪法” ， 又 称“散弹枪法” 。其是将供体生物的 DNA 用限制酶切割为许多片段，再用 运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。 只要有一个细胞获 得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。 该法最大的缺点是带有很大的盲目性， 工作量大，成功率低。且不能 将真核生物的基因转移到原核生物中去。 优点是速度快，简单易行，成本 较低，并能获得与天然基因组 DNA 一样的有内含子的真核基因 DNA 片段。 逆转录法（cDNA 法） 逆转录法合成 DNA 是人工模拟自然界某些生物的反转录过程。主要用 于分子量较大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA 为模板， 以 dNTP 为底物，酶催化按 5ˊ→3ˊ方向合成一条与 RNA 模板互补的 DNA 单链（cDNA） ，它与 RNA 模板形成 RNA 与 DNA 的杂交体。随后又在反转录 酶的作用下水解掉 RNA 链，再以 cDNA 为模板合成第二条 DNA 链。至此， 由 RNA 指导的 DNA 合成过程完成。 反转录-聚合酶链式反应法（PCR 法） 该法是将mRNA经反转录全成cDNA的第一链， 不需再合成cDNA第二链， 而是在特异引物的协助下， 用 PCR 法进行扩增， 特异地合成目的 cDNA 链， 用于重组、克隆。常用于含其极微量 mRNA 的细胞。 cDNA 文库 cDNA 文库是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部 mRNA 反转 录成 cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达 基因的转录本。 原理是将带 poly （A） 的 mRNA 经酶促反应转变为双链 DNA， 再与原核载体连接。 cDNA 文库的构建 cDNA 第一链的合成 利用反转录酶合成 cDNA 第一链 cDNA 第二链的合成 ①自身引导合成法单链 cDNA 的 3’端能够形成发夹状的结构作为引 物，在大肠杆菌聚合酶 I Klenow 或反转录酶的作用下，合成 cDNA 的第二 链.此法存在的缺点是在以 S1 核酸酶切割 cDNA 的发夹状结构时，会导致 对应于 mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排. ②置换合成法以第一链合成产物 cDNAmRNA 杂交体作为切口平移的 模板， RNA 酶 H 在杂交体的 mRNA 链上造成切口和缺口,产生一系列 RNA 引 物，在大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的作用下合成 cDNA 的第二链.此法的优点 是合成 cDNA 的效率高；直接利用第一链的反应产物，不需纯化；避免 使用 S1 核酸酶来切割双链 cDNA。 ③引物-衔接头法 ④Okayama-Berg 法合成并克隆双链 cDNA 双链 cDNA 分子的克隆 ①同聚物加尾法 利用小牛胸腺末端转移酶在双链 cDNA 和质粒载体 的 3’