简述核酸疫苗制备过程

简述核酸疫苗制备过程简述核酸疫苗制备过程 核酸疫苗又称基因疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的外源直接导入动物细 胞， 在宿主细胞中表达并合成抗原蛋白，并激起机体一系列类似于疫苗接种的免 疫应答；起到预防和治疗疾病的目的。自 1990 年 Wolff 等人意外发现核酸疫苗 后， 其相关的研究得到了广泛的重视， 并得以迅速发展， 誉为 “第三次疫苗革命” 。 本文就核酸疫苗的构建、特性、免疫机制、接种方式、影响因素、研究现状和前 景作一综述。 一一 核酸疫苗的构建核酸疫苗的构建 核酸疫苗是由编码病原体抗原的基因和作为真核细胞表达载体的质粒 DNA 组成。 病原体抗原的编码基因可以是一组相关基因或单一病原体免疫保护性抗原 基因， 也可以是编码抗原决定簇的一段 DNA 序列， 其表达产物应是病原体的有效 成分，可以引发保护性免疫。用于构建核酸疫苗的载体质粒多以 pUC 或 pBR322 质粒为基本骨架，主要包括启动子、增强子和 3’端多聚 A。巨细胞病毒（CMV） 启动子和 ROUS 肉瘤病毒（RSV）的启动子都可在哺乳类细胞内表达。另外也有人 采用来自哺乳动物和禽类的启动子。Fynan 等 1993 年将编码流感病毒血凝素 H 或 H7 的 CDNA 片段插入 CMV 质粒的转录调控元件的下游， 构建了抗流感病毒的核 酸疫苗，另外，乙型肝炎病毒、人免疫缺陷综合症病毒、脑膜炎病毒等基因均被 成功地克隆到含 CMV 启动子的真核表达载体上，并表现了免疫活性。用于构建 核酸疫苗的病毒载体包括流感病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、脊髓灰 质炎病毒等。 1994 年 Castrucci-MR[6]把可以引起保护性免疫反应的致死性淋巴 细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）的表位基因片段克隆到流感病毒（H1N1）的基 因组中制备核酸疫苗，免疫小鼠后， 可使小鼠抵抗致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎 病毒的攻击，其免疫效果可维持 4 个月以上。 二二 核酸疫苗的特点核酸疫苗的特点 与传统的灭活疫苗、 弱毒疫苗和基因工程疫苗相比， 核酸疫苗具有如下特点 （1）免疫效果好，基因疫苗能在宿主细胞中产生外源性蛋白，此种蛋白比原核 生物表达系统中产生的蛋白更象天然分子， 其抗原识别递呈过程与自然感染十分 相似，从而引起几乎等同于感染这些病原体或弱毒疫苗免疫后所产生的免疫应 答，并且避免了基因重组技术在体外合成的蛋白质抗原表位丢失或改变。（2） 利用一种表达载体同时表达多种蛋白，诱导机体产生针对多种病原体的免疫应 答， 从而起到一次注射核酸疫苗同时预防和治疗多种疾病的效果，并可抵抗某些 变异病原体的侵袭（3）核酸疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内，可直接与 MHC I 类和 MHC II 类分子结合，引起广泛的细胞免疫和体液免疫，但无毒力返 祖的危险（4）安全性好，由于核酸疫苗一般采用表达载体在动物细胞体内进行 抗原表达， 不与宿主染色体 DNA 整合， 但能在宿主体内表达， 与病毒活疫苗相比， 避免了病毒本身存在的复毒和病毒基因组整合到宿主染色体的危险（5）核酸疫 苗具有共同的理化特性，可在同一载体上构建表达多种抗原，生产多价疫苗或同 时注射 2 种以上的核酸疫苗来进行联合免疫（6）制备简单，利用成熟的基因重 组技术，将克隆的目的基因 DNA 直接接种，避免了表达载体的构建，表达产物的 提取等繁琐过程（7）由于核酸疫苗作为重组质粒，能在工程菌内快速大量增殖， 且提取方法简便，可使生产成本降低，并能加工干燥，便于储藏和运输。 三三 核酸疫苗免疫机理核酸疫苗免疫机理 对核酸疫苗免疫机理说法不一， 大多数学者认为，其致病机理在于他模拟了 病毒的自然感染过程。DNA 质粒在注射部位被肌细胞吸收摄取后，通过所含的启 动子和增强子系统调节合成所编码的蛋白质， 合成的蛋白质被细胞内蛋白酶复合 体降解成含病毒抗原表位的肽段，进入内质网与合成 MHCI 类分子结合，然后被 转运系统递呈到细胞膜表面，此复合体共同激活CD8CTL，部分被分泌或释放入 血的蛋白质，激活特异性B 细胞，从而产生保护性抗体；另外，分泌的蛋白质被 巨噬细胞或树突状细胞等专职抗原递呈细胞俘获，被加工成肽段，进入溶酶体/ 内体区与 MHC II 类分子结合，激活受 MHC II 类分子限制的 CD4Th 细胞，被激 活的 Th 细胞分泌 IFNγ、IL-2 等细胞因子，，进一步促进和强化体液免疫和 细胞免疫。另外，试验证明质粒上的氨苄青霉素抗性选择基因中的回文结构 5’ -AACGTT-3’能够使单核细胞产生白细胞介素-12，刺激细胞分泌干扰素，增强 NK 细胞的活性，称为“单链免疫刺激 DNA 序列”起到佐剂的作用。 四四 核酸疫苗的接种方式核酸疫苗的接种方式 核酸疫苗可以通过多种方式、 途径接种到机体的适当部位，不同的接种方式 或途径可影响其免疫效果。接种途径依启动子的来源而有所区别，用动物病毒和 一般哺乳动物启动子构建的 DNA 疫苗一般用生理盐水稀释质粒 DNA 肌肉注射法， 如股四头肌和腓肠肌等骨骼肌因为其特殊结构如肌浆网、横向微管系统，适合于 摄取和表达 DNA， 兼之其注射方便， 因而常被选为接种组织， 也可选择肌肉皮下、 腹腔内、静脉内接种。而用来自乳腺的乳清酸蛋白（WAP）启动子构建的疫苗在 乳腺和皮下脂肪接种效果更好；也有鼻腔内滴鼻法进行黏膜吸附免疫接种。第二 种方法是用高速度来提高疫苗 DNA 对组织的转染率和表达效率， 一般用特殊工具 -基因枪接种，基因枪能将包裹在金粒上的质粒 DNA 直接注射进表皮细胞。用基 因枪接种比直接注射核酸疫苗的免疫效果好 60-600 倍。用基因枪接种只需 0.4-0.004g 纯化 DNA，而肌肉注射需 100-200g 的核酸疫苗，才能获得很明显 的免疫效果。 Fynan[2]等人进行了不同方式接种流感病毒核酸疫苗免疫效力的研 究证明上述二者的接种效果均高于静脉、鼻腔、真皮、皮下等其它接种方式，但 不同宿主细胞所产生的免疫接种效果并不完全一致。 第三种方法是将组织预先用 药物如丁哌卡因、心肌毒素和高渗蔗糖等处理， 增加组织细胞对疫苗 DNA 的摄取 和表达能力，称为“药物协助法” 。另有人将疫苗 DNA 与粒细胞、巨噬集落刺 激因子表达载体或一些细胞因子等一起或分别注射均能明显的提高疫苗免疫效 率。 还有用腺病毒介导或脂质体介导注射方法的报道，但存在潜在癌基因激活及 缺乏细胞的导向性等缺点。 五五 核酸疫苗免疫效果的影响因素核酸疫苗免疫效果的影响因素 （1）表达载体对核酸疫苗的影响 表达载体对核酸疫苗的效力有很大的影响，表达载体主要以 pUC 和 pBR322 质粒为基本骨架，含 DNA 复制起始点、抗生素抗性基因、启动子、增强子和 3’ 多聚 A 终止信号等结构， 能在大肠杆菌中稳定地复制，但不能在哺乳动物细胞中 复制。 其中控制外源基因表达的启动子对载体的影响最大。启动子因来源不同有 组织特异性，并且在各种组织中起始 mRNA 合成的效能也不同。基因疫苗中常用 的来自病毒的启动子包括猴病毒 40（SV40）早期启动子、巨细胞病毒（CMV）早 期启动子及罗斯肉瘤病毒（RSV）启动子等，这些启动子的组织特异性