完整版Illumina测序基础知识

完整 word 版Illumina 测序基础知识 第一个要给大家讲的，是它这个 flowcell。Flowcell 翻成中文，就叫“流动池”. 我们来看这个图片。图片当中,我们看到一个象载玻片大小的芯片.这个芯片里面，是做了 8 条 通道。 在这个通道的内表面，是做了专门的化学修饰。它的化学修饰，主要是用 2 种 DNA引物， 把它2 种 DNA 引物）种在玻璃表面。 这两种（DNA 引物的）序列是和接下来要测序的DNA 文库的接头序列相互补的。而且这2 种引物 是通过共价键，连到 Flowcell 上去。之所以要用共价键连到 Flowcell 上去，是因为接下来有 大量的液体要流过这个 Flowcell，只有有共价键连接的这些 DNA，才不会被冲掉。这就是 Flowcell。 文库制作文库制作 再接下来,讲一下文库、和文库的制作（过程 所谓的 DNA 文库，实际上是许多个 DNA 片段，在两头接上了特定的 DNA 接头，型成的 DNA 混合 物。 文库有 2 个特点,第 1 个特点，是当中这一段插入的DNA，它的序列是各种各样的。第2 个特点， 它的两头的接头序列,是已知的,而且是人工特地加上去的。 要做这个文库，首先是把基因组 DNA,用超声波打断.然后打断之后，两头用酶把它补平，再用 Klenow 酶在 3’端加上一个 A 碱基.然后，再用连接酶把这个接头给连上去. 连好了接头的 DNA 混合物，我们就称为一个“文库”。英文也称作“library”。 桥式桥式 PCRPCR 做好了 Library 之后，就要做桥式 PCR 了。桥式 PCR,实际上是把文库种到芯片上去,然后进行扩 增,这样的一个过程. 这个过程，首先是把文库加入到芯片上，因为文库两头的 DNA 序列，和芯片上引物是互补的,所 以,就会产生互补杂交. 1 完整 word 版Illumina 测序基础知识 杂交完了之后，我们在这里面加入 dNP 和聚合酶。聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条 全新的 DNA 链来。 新的这条链，和原来的序列是完全互补的。 接下来,我们再加入 NaOH 碱溶液。DNA 双链在 NaOH 碱溶液存在下，就解链了。而且被液流一冲， 原来的那个（模板）链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。而和芯片共价连接的 链,就被保留下来。 然后，我们再在液流池里加入中性液体，主要是为了中和这个碱液,在加入中和液之后,整个环 境变成中性了。这时侯，DNA 链上的另外一端,就会和玻璃板上的第二种引物，发生互补杂交。 接下来，我们加入酶和 dNTP，聚合酶就延着第二个引物，合成出一条新链来；然后，我们再加 碱，把 2 条链解链解开；然后，我们再加中和液，这时侯,DNA 链会和新的引物杂交。再加酶, 再加 dNTP，又从新引物合成出新的链来。 连续重复这一过程，DNA 链的数量,就会以指数方式增长. 制备单链制备单链 在桥式 PCR 完成之后，接下来要做的工作，就是要把合成的双链，变成可以测序的单链。 办法是通过一个化学反应,把其中一个引物上的一个特定的基团给切断掉。 然后，再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯,碱让 DNA 的双链解链，那根被切断了根的 DNA 链就被 水冲掉了。留下那根共价键连在芯片上面的链. 接下来，再加入中性溶液，然后在这个中性溶液里面加入测序引物。 正式测序正式测序 好,接下来正式的测序工作就开始了。 那么， 在测序的时侯， 加入进去的,最主要是 2 个东西 一个是带荧光标记的 dNTP。 而这个 dNTP， 它还有一个特点，它的 3’末端是被一个叠氮基堵住的。 2 完整 word 版Illumina 测序基础知识 然后,再加一个聚合酶,聚合酶就会选择哪一个 dNTP 是和原来位置上的那个碱基是互补的，根 据互补性原理,把这个 dNTP 合成到新的这个 DNA 链上去。 因为这个 dNTP 的 3’端是被一个叠氮基团堵住了,所以，它一个循环只能延长一个碱基。然后， 它就停在那儿了. 合成完了之后，就用水把多余的 dNTP 和酶给冲掉. 冲掉之后，就放到显微镜下，去进行激光扫描.根据发出来的荧光来判断它是哪个碱基。 因为 4 种 dNTP，它每一种 dNTP 上面标的荧光素都不一样,根据红、黄、蓝、绿，它出来的哪种 颜色，那么，就可以倒过来推出来,这个新合成上去的碱基，是哪种碱基。 因为新合成的碱基，是和原来位置的碱基）是互补的，所以，又推出模板上那个碱基是哪个. 这一个循环完成之后，就加入一些化学试剂，把叠氮基团和旁边标记的荧光基团切掉。切完了 之后,3端的羟基就暴露出来。 再接下来，加入新的 dNTP 和新的酶，然后，又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后，把多余 的酶和 dNTP 冲掉，再进行一轮显微的激光扫描，再读一下这个碱基是什么。 不断重复这个过程,可以重复上百次，到几百次，就可以把上百个碱基,甚至更多碱基的序列读 出来。 读读 IndexIndex 那么，什么是 Index 哪是因为 Illumina 的评委会个测序量很大，往往一个样本，用不了那么 几亿条 DNA.所以，科学家就想了一个办法.在文库的接头上做了一些标记，每一个样本,它有一 个特定的接头，每个接头里面，它有一段特定的序列。 这段特定的序列，我们就称为 Index。也有人把它叫做 Barcode，反正，表达的是一个意思这 么一段特定的序列,标记了样本的来源。 那么，要读这个 Index 的序列，先用碱把上面这根测完“Read 1”的序列，把上面这根 DNA 链 给解链掉。 3 完整 word 版Illumina 测序基础知识 解链掉之后,再加入中性液，然后,加入“Read 2”这个测序引物。Read 2 测序引物结合的位点, 正好，就在这个 Index 序列的旁边. 接下来,就进行第 2 轮测序，一般来说，是读 6 到 8 个碱基。把这 6 到 8 个碱基读下来，我们就 可以知道,这某一个具体的一段 DNA，它来自于原始的哪个样本. 双端测序双端测序 这是 Illumina 的最核心的另外一个技术，就是双端测序。 那么双端测序，就是说,一根 DNA 链，除了从正向读一遍，还可以从 DNA 的负向,再读一遍。 这一下子就把 Illumina 测序的有效长度加了一倍。这是非常有实际用途的。 那么这个倒链的过程，是这样,先让这个 DNA 先合成，合成出来这根互补链. 有了这个互补链之后，用一个化学试剂,在原来这根链的根上切一下。切一下，原来这根模板链 就掉了，剩下那根互补链. 再接下来，就进行第 2 端的测序。第 2 端的测序原理，和第一端的测序原理是一样的。 加上了“Read 3“的这个引物，依次往下,一个一个碱基地往下读。 大规模平行测序大规模平行测序 那么最重要的事情是什么呢一个点，经过几百个循环，就读出了几百个碱基.但实际上，这个 芯片上可以有上亿个点，上亿个“cluster”，也就是“簇“。那么上亿个“cluster”，每个循 环,它都可以读出地么多序列,这是 Illumina 测序非常强大的原因.因为是成千上万，准确说是 上亿上链都在合成，这个就得到了很大的一个测序数