液相色谱串联质谱联用技术-实验指导(许煊炜)

液相色谱串联质谱联用仪检测技术液相色谱串联质谱联用仪检测技术 实实 验验 指指 导导 （（20142014、、20152015 级）级） 课程内容（一个实验 8 学时） （1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构 原理、操作及定性定量应用。 （2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中 7 种农药的残留量。 吉林农业大学吉林农业大学 农业部参茸质检中心农业部参茸质检中心 2017.032017.03 1 实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱 液相色谱串联 质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用 一一 . .实验目的和意义实验目的和意义 通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质 联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告 和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意 识） 。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实 际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。 （一）检测仪器 1、 仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS） 。型号4500 QTRAP（美国 Applied Biosystems公司） 。 2、 仪器组成液相色谱部分岛津 LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器； 串联质谱部分 QTRAP4500，配有 ESI 离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、 主要性能指标离子化方式ESI 电离 质量范围 （5 1700）amu 分辨率 6900质量 稳定性0.1 amu/12h灵敏度1pg reserpine, ESI, MRM扫描（m/z 609/195） ，信噪比S/N 1201 扫描速度4000 amu/sec质量准确度 0.01（全质量数范围） 4、 方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流 动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次 进入离子源。 在离子源中， 各组分以 ESI 或 APCI 方式电离， 被加速后进入质量分析器。 4500QTRAP 的质量分析器主要由 Q1、Q2、Q3 三组四级杆串联组成。Q1 可将分子离子按质荷比（m/z）大小分 开；Q2 是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3 具有四级杆和线性离子阱两种功能，作 为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵 敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录 即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。 4500QTRAP 通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技 术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物 进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC 计算机 Windows操作系 统支持下的 Analyst 软件控制完成。 2 （二）样品 1、样品要求本仪器适合分子量在 5 1700 amu 范围内的有机样品的定性及定量分析。待测 样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。若样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现 象时，应重新取样或重新配制溶液。 2、 试剂要求所有的试剂均选用色谱纯级， 所用水的电导率应大于 18KΩ。 流动相必须用 0.2m 或 0.45m 滤膜过滤后方可使用。 3、分离条件要求在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流 动相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐。 （三） 、操作步骤实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器的操作规程，仪器的工作状态、包括检测 灵敏度和分辨率，必须满足检测项目的要求。 1、 开机前准备开机前应检查仪器室内电、气的供应情况及空调机的工作状态是否稳定，检 查真空机械泵泵油是否需要更换。只有当UPS 工作正常，Gas1/Gas2、Curtain Gas 和 Exhaust Gas 的 压力分别稳定在 0.35、0.35 和 0.7 Mpa，环境温度为 1030℃，相对湿度小于 70时才能开机。 2、开机1 打开真空机械泵上的电源开关。2 真空机械泵继续工作至少15 分钟后，打开 MS 电源主开关。3 等真空度达到 210-5Torr（绿色指示灯不闪）后，打开PC 计算机电源 3、仪器调谐 （四） 、方法建立 1.在Analyst软件Tools菜单中选择Project→Create Project。 在Project name项下输入新建的Project 名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮点击OK，确认新建 Project。 2.在 Analyst 软件界面下，双击导航栏内Hardware Configuration。在弹出窗口中选择MassOnly， 点击 Activate Profile，激活 MassOnly（只联接质谱主机） 。 3.在导航栏内单击 Tune and Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的T 钮。此时，应注 意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击Manual Tuning，进 入质谱参数设置及运行窗口。 4.使用 1mL 玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击MS 下拉菜单，选择 Syringe Pump ，设定针泵流速 Flow Rate 为 10μL/min。 5.点击 Start Syringe Pump按钮开针泵进样。 6.返回 MS ，选择扫描模式Scan Type为 Q1 MS，设定扫描速度Scan Rate 为 10Da/s，设 定扫描范围 StartStop 设定为 50化合物分子量。DP 预输入 60。 7.点击 start 开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值 3 在约 E4 以下。点击stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。点击右 键，选择 Delete Pane。 8.设定 Scan type 为产物离子扫描 Product Ion（Ms2） ，扫描速度 200Da/s，选择扫描正/负离子， 输入母离子（product of） ，设定扫描范围 startstop 为 50MW20，覆盖可能的子离子质量范 围，点击 compoud 标签，设定（DP）60， （CE）5。 9.点击 start，开始采集数据， 注意观察是否有预期的母离子出现。 手动调节 CE，以 5eV 为步长， 逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选 择子离子。 10.选择 Scan Type为 MRM。 设定参数表格中的 Q1 对应的母离子， Q3 对应的子离子， time （ms） 为 50，ID 值设为名称 1（定量）