抗体的提取与纯化

]抗体的提取与纯化 抗体的提取与纯化 关键词抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法； DEAE-SephadexA-50柱层析纯 化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化 IgG；离子交换层析 精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离 IgG 时，多结合使 用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取 IgM 的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳 法，或离子交换与凝胶过滤等。 一、盐析法 取 x ml 血清加 x ml 生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml 饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为 50。 ↓4℃，3h 以上，使其充分沉淀离心 （3000rpm）,20min,充上清，以 xml 生理盐水溶解沉淀， 再逐滴加饱和硫酸铵 x/2ml。 ↓置 4℃3h 以上，[此时， （NH4）2SO4 的饱和度为 33]重复上述第二步过程1～2 次。末次 离心后所得沉淀物为 γ-球蛋白，以 0.02mol/L pH7.4PBS 溶解至 xml 装入透析袋。 ↓对 PBS 充分透析、换液 3 次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4为止。 取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751 型紫外分光光度计测定蛋白含量。 影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和 pH，温度等都可影响盐析的 结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节） 。 二、冷酒精沉淀法 分离过程如下。血清加 3 倍体积的蒸馏水，调节 pH 至 7.7冷却到 0℃。在激烈搅拌的条 件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为 20，保持在-5℃。产生的沉淀（A） ，含有大 多数种类的免疫球蛋白。沉淀A 悬浮于 25 倍体积的 0.15～20mol/L NaCl 溶液（冷）中，加 有 0.05mol/L 醋酸调节 pH 到 5.1，产生的沉淀（B） ，包括大部分的 IgA 和 IgM，IgG 留在上 清液内。 调节上清液的 pH 到 7.4， 加冷酒精 （-20℃～-30℃） 到最终浓度为 25， 维持在-5℃。 所得到的沉淀（C）含有 90～98IgG。不同动物，IgG 分离的条件和产量略有不同。见表 2-5。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA 和 IgM 的混合物将沉淀（ B）悬浮在0℃ 水中，调节 pH 到 5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。 然后加冷酒精到最终浓度为 10，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含 IgA 和 IgM。 表 2-5 从几种动物和人血清沉淀A 分离 IgM 的条件 物种 pH沉淀条件 IgG 产量 酒精浓度（）离子强度 人 5.1 15. 0.01 65 山羊 5.2 0 0.01 65 家兔 5.2 10 0.01 70 大鼠 5.0 15 0.01 50 豚鼠 5.1 15 0.01 70 三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白 原理DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基乙基-葡萄糖凝胶 A-50）为弱碱性阳离子交换剂。用 NaOH 将 Cl-型转变为 OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点 为 pH6.85～7.5） ，其余均属酸性蛋白。PH7.2～7.4 的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析， γ 球蛋白便可在洗脱中先流出，而 其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG. （一）操作步骤 1．DEAE-Sephadex A-50 预处理称 DEAE-SephadexA-50（下称 A-50）5g，悬于 500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上 层细粒。按每克 A-50 加 0.5mol/LNaOH 15ml 的比例，将 A-50 浸泡于 0.5mol/LNaOH 液中， 搅匀，静置 30min，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈 中性； 再以 0.5mol/LHCl 同上操作过程处理， 最后以 0.5mol/LNaOH 再处理一次。 处理完后， 将 A-50 浸泡于 0.1mol/LpH7.4PB 中过夜。 2．装柱 （1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关 闭开关。 （2）将 0.1mol/L,pH7.4PB 沿玻璃棒倒入柱中至 1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液 调成稀糊状的 A-50。等 A-50。等 A-50 凝胶沉降 2～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流 速 1ml/min，同时连续倒入糊状 A-50 凝胶至所需高度。 （3）关闭出水口，待 A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。 通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3．平衡 启开出水口螺旋夹，控制流速 12～14 滴/min。使约 2 倍床体积的洗脱液流出。并以 pH 计 与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止 平衡。 4．加样及洗脱 启开上口橡皮塞入下口螺旋夹， 使柱中液体缓慢滴出， 当柱面液体与柱面相切时， 立即关闭 出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品 （体积应床体积 2，蛋白浓度以100mg 为宜） 。松开 出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内， 至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱 壁 2～3 次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞 柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14 滴/min。 5．收集 开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集 10～15 管。 6．测蛋白 以 751 型紫外分光光度计分别测定每管 OD280nm, 与 OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。 并以 OD280nm 为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。 7．合并、浓缩 将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并， 以 PEG （MW6000） 浓缩至所需体积， 加入 0.02NaN3 防腐，于 4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。 8．A-50 凝胶的再生 在柱上先以 2mol/LNaCl 洗脱蛋白至流出液的 OD280nm0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。 然后 按预处理过程将 A-50 再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中 4℃保存；近期 不用时，以无水酒精洗2 次，再置 50℃温箱烘干，装瓶内保存。 （二）注意事项 （1）柱的选择从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速 同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动 的不均匀性增加，分辨率明显下降。 （2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH 及离子强度。样品与A-50 凝胶必须用洗脱缓冲液 彻底平衡后，才能进行柱层析。 （3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。 （4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。 （5）上样的体积要小，浓度不宜过高。