人转化生长因子β1TGF

人转化生长因子人转化生长因子β β 1 1（（TGF-TGF-β β 1 1）酶联免疫分析）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关 液体样本中转化生长因子β1（TGF-β1）的含量。 实验原理实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人转化生长因子β 1（TGF-β 1）水平。用纯化 的人转化生长因子β 1（TGF-β 1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中 加入转化生长因子β 1（TGF-β 1） ，再与 HRP 标记的转化生长因子β 1（TGF-β 1）抗体结 合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶 的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的转化生长 因子β 1（TGF-β 1）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ，通过标准 曲线计算样品中人转化生长因子β 1（TGF-β 1）的含量。 试剂盒组成试剂盒组成 试剂盒组成 说明书 封板膜 密封袋 酶标包被板 标准品1800ng/L 标准品稀释液 酶标试剂 样品稀释液 显色剂 A 液 显色剂 B 液 终止液 浓缩洗涤液 48 孔配置 1 份 2 片（48） 1 个 148 0.5ml1 瓶 1.5ml1 瓶 3 ml1 瓶 3 ml1 瓶 3 ml1 瓶 3 ml1 瓶 3ml1 瓶 （20ml20 倍）1 瓶 96 孔配置 1 份 2 片（96） 1 个 196 0.5ml1 瓶 1.5ml1 瓶 6 ml1 瓶 6 ml1 瓶 6 ml1 瓶 6 ml1 瓶 6ml1 瓶 （20ml30 倍）1 瓶 保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 样本处理及要求样本处理及要求 1. 血清室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次 离心。 3. 尿液用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 1 4. 细胞培养上清检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/ 分） 。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞 浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分 钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4） ，用手工或匀浆器 将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。分装后一份待 检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤操作步骤 1.标准品的稀释与加样在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标 准品 100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二 孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔， 再在第三、 第四孔分别加标准品稀释液50μl， 混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔 中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各 取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混 匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准 品稀释液 50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。 （稀释后各孔加样量都为50μl， 浓度分别为 1200 ng/L，800ng/L ，400ng/L，200ng/L，100ng/L） 。 2.加样分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、待测样 品孔。 在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl， 然后再加待测样品 10μl（样 品最终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混 匀。 3.温育用封板膜封板后置37℃温育 30 分钟。 4.配液将 30（48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T 的 20 倍）倍稀释后备用。 5.洗涤小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。 6.加酶每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育操作同 3。 8.洗涤操作同 5。 9.显色每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15 分钟. 10. 终止每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。 11. 测定以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值） 。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。 注意事项注意事项 1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。 2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 2 控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值 大于标准品孔第一孔的OD 值） ，请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（n5） 。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6． 底物请避光保存。 7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9． 本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 计算计算 以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释