基因工程复习资料 精心整理

第一章 绪论 1.基因工程的定义在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。 2.基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现 3.基因工程的基本步骤 （1）目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 （2）重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 （3）重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 （4）克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。 （5）目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 4.基因工程的意义 （1）基因工程在农业生产中的应用提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。 （2）基因工程在工业中的应用 1）纤维素的开发利用克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。 2）酿酒工业用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。 （3）基因工程在医药上的应用用微生物生产药物； 用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂--疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。 （4）基因工程在环境保护中的作用 1）检测水污染用重组细菌或转基因鱼等检测水污染 2）生物降解用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。 （5）基因工程商业化的发展 第二章 基因工程主要技术原理 1．质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么 质粒的提取和纯化方法 最常用的为碱抽提法 原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快。染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。 步骤1）溶菌溶液I（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA,4-5mg/ml 溶菌酶） 2）破膜溶液II（0.2N NaOH 1.0SDS） 3）中和溶液III（3M醋酸钠 pH4.8） 4）离心 5）转移将上清转移到一个新的离心管中 6）抽提酚-氯仿抽提，酚/氯仿/异戊醇25/24/1 7）沉淀用0.6倍体积的异戊醇或2倍体积的乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸铵辅助沉淀） 23 / 1 基因组DNA的提取纯化方法 （1） 细菌基因组DNA的制备 细胞裂解（10SDS和蛋白酶K。SDS是阴离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。 ）DNA纯化（CTAB十六烷基三甲基溴化铵 除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。 ）沉淀DNA（0.6倍体积的异丙醇或2倍乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）） （2） 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提 组织粉碎（动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末；组织培养的细胞用胰酶消化 松散后直接使用。）细胞裂解（0.5SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50℃温育。）沉淀DNA（用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇。（加入1/10体积的3M醋酸氨可以辅助沉淀）。） （3） 从植物组织中制备 DNA 组织粉碎（用液氮冷冻后研磨成细粉末。）细胞裂解（用2CTAB/2-ME 十六烷基三甲基 溴化铵/2巯基乙醇）或1 SDS和蛋白酶K。 65 ℃温育。）沉淀DNA（用0.6倍体积的异丙醇（-20℃）。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）） 2.DNA的定量和纯度测定方法 （1）紫外光谱法 DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，蛋白质在280nm波长处有特异的紫外吸收峰 ，对于纯DNA OD260/OD280 1.8，若低于1.8说明有蛋白质杂质 （2）琼脂糖凝胶电泳估计 溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。 3.琼脂糖凝胶电泳基本原理及应用 原理将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。相同分子量的DNA闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开放开环状最慢。 琼脂糖凝胶电泳的应用用于对DNA分子量的估计，DNA片段的分离和回收。 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳 1111- ，-甲叉双丙烯酰胺N聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体Acrylamide和交联剂NN，Nmethylene bisacrylamide在催化剂的作用下聚合而成。引发剂过硫酸铵，加速剂TEMED。电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。凝胶浓度越大，空隙越小。电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片。 5.核酸杂交原理、类型及应用 原理核酸分子杂交技术是依据核酸分子碱基互补、变性和复性原理，用标记的已知序列的单链核酸片段DNA或RNA作为探针,与未知的核酸片段进行杂交, 形成异源性杂交分子，然后通过标记信号的检测，鉴定样本中是否存在与探针互补的靶序列DNA。包括DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。 特点特异性高；灵敏度高；定位准确 应用基因克隆的筛选；酶切图谱制作；基因组中特定基因序列的定量和定性检测； 基因表达的分析；基因突变分析；疾病的诊断、微生物病原体检测。 变性在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。 23 / 2 ，此时melting temperature,Tm1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（A260值达到最大值 C含量有关。Tm与核酸的G、50的DNA分子发生了变性。0.4169.3 （GC）Tm Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。 DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。复性在适当条件下，变性即可恢复双链螺旋℃时，变性的单链DNATm值低20-30在热变性后，当温度缓慢冷却至比 结构，这样的复性又称为退火。在杂交前可用封闭物将这预杂交为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的