westernblot试验步骤

W We es st te er rn nb bo ol lt t 一、实验目的 通过实验了解 westernblot 技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式 ,特别是用于蛋白质纯度检测 和测定蛋白质分子量。PAGE 能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差 异,而 SDS-PAGE 的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸 钠），SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS 的量几乎总 是与多肽的分子量成正比而与其序列无关， 因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶 电泳中的迁移率只与多肽的大小有关， 在达到饱和的状态下， 每克多肽可与 1.4g 去污剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对 数呈线性关系，符合下式logMWK-bX，式中MW 为分子量，X 为迁移率，k、b 均为常数， 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一 条标准曲线， 未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标 准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜nitrocellulosefiltermembrane，简称 NC 膜，在胶体金试纸中 用做 C/T 线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC 膜是生物学试验中最重 要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即 抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光 HRP 底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为 ECL 试剂）是目前 Westernblot检测中最为灵敏的试剂。 显影液的 A 液主要成分为鲁米诺 （Luminol） 及发光增强剂，B 液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有 HRP（辣根过氧化物 酶），可以催化 A 液和 B 液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC 膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X 射线摄影暗匣 8.X 射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer1L Tris15.1g Glycine94.0g SDS5.0g ddH2O 定容至 1L 使用前稀释 5 倍 2.Transferbuffer 10Transferbuffer1L Tris30.3g Glycine144.0g ddH2O 定容至 1L 使用前稀释 10 倍，加入 1/4 体积的甲醇 3.TBS 10TBS500mL Tris12.1g Nacl40.0g ddH2O 定容至 500mL 用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.6 4.TBST1L 1TBSTween-2010001 ddH2O 定容至 1L 5.5的脱脂奶粉溶液50ml 脱脂奶粉 2.5g TBST 定容至 50ml 6.一抗溶液 7.二抗溶液 8.显影液现配现用，溶液 A溶液 B11 配置。 9.SDS-PAGE（配方见下一页） 五、操作步骤 1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.1SDS-PAGE 胶的配置 ①先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。 ②准备好试剂。 ③计算所需要使用试剂的量。 例6的分离胶，每块胶板分离胶约需要 7ml，10 块胶，共需要 70ml ④将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板有 正反之分，上面的“up”朝上。 ⑤准备配胶按照上面配方依次添加。 注意1.添加量少的试剂要注意混匀 2.TEMED，APS 要最后加 ⑥配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越 是浓度高的胶液凝的越快。 ⑦分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面， 注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢 不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。 ⑧半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。凝 结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。 ⑨配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约 3ml。 注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子的 时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。 A.A.分离胶分离胶 6GEL H2O 40Acr/bis 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10SDS 5ml 2.85 0.75 1.3 7ml 3.99 1.05 1.82 8ml 4.56 1.2 2.08 10ml 5.7 1.5 2.6 0.050.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110AP（过硫酸0.05 铵） TEMED 8GEL H2O 40Acr/bis 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10SDS0.05 0.004 5ml 2.6 1 1.3 0.0056 7ml 3.64 1.4 1.82 0.0064 8ml 4.16 1.6 2.08 0.008 10ml 5.2 2 2.6 0.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110AP（过硫酸0.05 铵） TEMED 10GEL H2O 40Acr/bis 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10SDS 0.003 5ml 2.35 1.25 1.3 0.0042 7ml 3.29 1.75 1.82 0.0048 8ml 3.76 2 2.08 0.006 10ml 4.7 2.5 2.6 0.050.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110AP（过硫酸0.05 铵） TEMED 12GEL H2O 40Acr/bis 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10SDS0.05 0.002 5ml 2.1 1.5 1.3 0.0028 7ml 2.94 2.1 1.82 0.0032 8ml 3.36 2.4 2.08 0.004 10ml 3.3 4.0 2.5 0.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110AP（过硫酸0.05 铵） TEMED 15GEL H2O 40Acr/bis 0.002 5ml 1.725 1.875 0.0028 7ml 2.415 2.625 0.0032 8ml 2.76 3 0.004 10ml 3.45 3.75 1.5Mtris-HCl （pH8.8） 10SDS 1.31.822.082.6 0.050.07 0.07 0.08 0.08 0.1 0.110AP（过硫酸0.05 铵） TEMED B.B.浓缩胶浓缩胶 0.0020.00280.00320.004 5GEL H2O 40Acr/bis 1.0Mtris-HCl （pH6.8） 10SDS 2.02ml 1.48 0.25 0.25 4.04ml 2.96 0.50 0.50 6ml 4.44 0.75 0.75 10ml 3.4 0.83 0.6