BDFACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤corrZY

B B D D F F A A C C S S C C a a l l i i b b u u r r流流 式式 细细 胞胞 仪仪 简易操作步骤 一、开机一、开机 1）先打开净化交流稳压电源，其次打开110V 稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最 后打开计算机。 2）向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色 箭头所示）方向调在 VENT位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的 3/4 左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN位置。 二、开启二、开启 CellQuestCellQuest 软件、编辑实验文件软件、编辑实验文件 1）在屏幕下方点击 CELLQuest（第四个图标）启动软件。桌面会出现一’Untitled’实验文 件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。 2）从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然 后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四 个小黑块）。 3）在出现的散点图对话方框中点击PlotSource，选择 AcquisitionandAnalysis收取、分 析，确认 X 和 Y 轴参数预设为 FSC-H1024、SSC-H1024。 4）从屏幕上方 Plots 菜单中选择 DotPlot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的 对话方框内选择 X 轴FL1-H1024；如果是双标，Y 轴选择FL2-H1024根据实验检 测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明，如果是单标，Y 轴选择SSC-H。 点击 OK，FL1/FL2 的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。 说明说明散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立 参数的相互关系。在图中，横坐标X 轴和纵坐标 Y 轴参数分别设为 FSC-H1024、SSC- H1024；双荧光标记时，第二图X 和 Y 轴参数分别设为 FL1-H1024、FL2-H1024，X 轴为 为荧光 1 强度的相对值，单位是道数，Y 轴则通常表示荧光 2 或光散射强度的相对值。仪 器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。修改动作为轻击图谱上X 和 Y 轴参 数，并依需要选择之（FSC细胞大小，SSC细胞折射率，FL1FITC 绿色荧光， FL2PE 橙色荧光，FL3PerCP 红色荧光）。 5）在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2 散点图上拖动 Quadrant的中心将它设定在（x，y）＝（101，101） 处，这些象限将指定阴性/阳性区域。 6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点 击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。单色荧光 只需一个直方图，和第二个散点图一样，横坐标选择 FL-1，纵坐标默认为 Counts；若是双色荧光，需画2 个 直方图，一个横坐标选择FL-1-1024，另一个横坐标选 择 FL-2-1024； 7）在上面直方图中画出M1 和 M2，其中 M1 代表隐性数目（一般标示是10 ），M2 代表 阳性数目（除 M1 以外所有的部分）。 8）从 Stats 菜单中选择 QuadrantStats（象限统计）,5）步骤中的点图将分为四个象限。 三、建立仪器和计算机之间通讯三、建立仪器和计算机之间通讯 1 从 Acquire 菜单中选择 ConnecttoCytometer快捷键 Winb，此时会出现 AcquisitionControl对话方框。 四、仪器设置文件四、仪器设置文件 注意注意实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更 改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件 （Instrumentsettings），含信号器高压（Detector/Amps），阈值（Threshold），荧光补 偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps-- Threshold--Compensation。 1）检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择 Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在 Detectors/Amps窗口确认 FSC 与 SSC（根据实验样品确 定，一般细胞选择 LIN，细菌选择 LOG），其它 FL1-3 为 LOG（对数放大），将其拖至空白区。 2）从 Cytometer菜单中选择 Threshold，出现 Threshold窗口在 Threshold窗口确认 FSC 为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。 3）从 Cytometer菜单中选择 Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白 区。 五、上样品、设置仪器五、上样品、设置仪器 使仪器处于 HighRUN，样品管支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认 AcquisitionControl窗口中Setup 前需打叉或打勾即不储存数据，用于仪器设置，点 击 Acquire。 1 1、调节、调节 FSC/SSCFSC/SSC 探测器（电压）探测器（电压） 观察 FSC/SSC 图的变化。FSC 电压Voltage预设为 E00，可调节 AmpGain从 1.00 9.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC 电压设置于 E-1；较小细胞，将 FSC 电压设置于 E01）。调节 SSC 电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC 图的 原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现 象。调整定位后，点击AcquisitionControl窗口中的 Pause。 2 2、、GatingGating 圈选圈选 细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射（FSC）与侧方 散射（SSC）的二维位图，即散射光图谱（ScatterPlot），来圈选出不同细胞群的范围， 选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。 1）在工具板中选择多边形的Region，在 FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如 下图）。分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的 细胞。如果要删除 R1 区域，您可以在工具列中点选GatesGates→→RegionlistRegionlist，以鼠标点选 R1R1，再按 DeleteDelete 键删除 R1R1 区域。删除 R1 区域后，可用绘图工具板，重画R1R1。。 2）选取希望 Gate的 FL1/FL2散点图，从 Plots 菜单中选择 atdotplot。在出现的对 话方框内，将 NoGate 改选 G1R1。点击 OK。 3 3、调节、调节 FL1FL1、、FL2FL2 的探测器（电压）的探测器（电压） 1）点击 AcquisitionControl窗口中的 Restart。在 Detector/Amps窗口中调节 FL1、FL2 的电压，使 NegativeCont