食品中罗丹明B的测定

食品中罗丹明 B 的测定 BJS 201905 1范围 本方法规定了食品中罗丹明B 的液相色谱测定方法及液相色谱-质谱/质谱确证方法。 本方法适用于半固态调味料、花椒及花椒粉、花椒油、牛肉干、蜜饯、水果干制品中罗 丹明 B 的测定和确证。 2原理 试样中罗丹明 B 用含酸的甲醇水溶液提取后，经混合型阳离子固相萃取小柱净化，采 用液相色谱荧光检测器检测，外标法定量。试样中检出罗丹明B 后采用液相色谱质谱/质谱 法进行确证。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。 3.1甲醇（CH3OH）色谱纯。 3.2乙腈（C2H3N）色谱纯。 3.3甲酸（CH2O2）色谱纯。 3.4氨水（NH₃H₂O）色谱纯。 3.5含 0.1甲酸的水溶液 取甲酸（3.3）1 mL 用水稀释至 1000 mL， 用滤膜（0.22 μm， 水相）过滤后备用。 3.650甲醇水溶液准确量取 500 mL 甲醇（3.1）于 1 L 容量瓶中，用水定容至刻度。 3.7含 0.1甲酸的甲醇水溶液 取 1 mL 甲酸 （3.3） ， 用甲醇水溶液 （3.6） 稀释至 1000 mL。 3.8含 0.1甲酸的乙腈溶液取1 mL 甲酸（3.3），用乙腈（3.2）稀释至1000 mL，滤膜 （0.22 μm，有机相）过滤后备用。 3.9含 0.1甲酸的乙腈水溶液取0.1 mL 甲酸（3.3）和35 mL 乙腈（3.2），用水稀释至 100 mL，混匀。 3.10含 5氨水的甲醇溶液取5 mL 氨水（3.4），用甲醇稀释至100mL，混匀。（临用 现配） 3.11罗丹明 B 标准品 罗丹明 B 标准品的分子式、 相对分子量、 英文名称、 CAS 登录号见表 1， 纯度≥99。 表 1 罗丹明 B 标准品的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量 中文名称 罗丹明 B 英文名称 Rhodamine B CAS 登录号分子式 C28H31ClN2O3 相对分子量 479.0181-88-9 3.12罗丹明 B 标准储备液准确称取罗丹明 B 标准品 10 mg（精确至 0.0001 g），置于 100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL 的标准储备液。 溶液转移至试剂瓶中，置于-18℃避光保存，有效期为 6 个月。 3.13中间标准溶液准确移取0.5 mL 罗丹明 B 标准储备液（3.12）于 100 mL 容量瓶中， 用甲醇定容至刻度，混匀，此溶液的浓度为500 ng/mL。置于 4℃避光保存，有效期为 1 个 月。 3.14标准工作溶液用含 0.1甲酸的乙腈水溶液（3.9）将中间标准溶液（3.13）稀释成 0.0 ng/mL、 0.5 ng/mL、 1.0 ng/mL、 2.0 ng/mL、 5.0 ng/mL、 10.0 ng/mL、 20.0 ng/mL、 50.0 ng/mL 的标准工作溶液。临用现配。 3.15混合型阳离子固相萃取柱 （60 mg/3mL）基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高 聚物，或相当者。使用前依次用3 mL 甲醇，3 mL 水活化。 3.16陶瓷均质子。 4仪器和设备 4.1液相色谱仪配荧光检测器。 4.2液相色谱-质谱/质谱仪配有电喷雾离子源（ESI 源）。 4.3旋涡混合器。 4.4离心机转速≥8000 r/min。 4.5电子天平感量分别为 0.0001 g 和 0.01 g。 4.6具塞离心管50 mL。 4.7组织捣碎机。 4.8固相萃取装置。 5试样制备与保存 5.1半固态调味料 取适量样品，捣碎，混匀，常温保存备用。 5.2花椒及花椒粉 取适量样品，粉碎后过40 目筛，常温保存备用。 5.3花椒油 充分混匀，常温保存备用。 5.4牛肉干 取适量样品，捣碎，混合均匀，冷藏保存备用。 5.5蜜饯、水果干制品 取适量样品，捣碎，混合均匀，冷藏保存备用。 6测定步骤 6.1试样前处理 提取准确称取 2 g（香辛料样品称取 1 g，精确至 0.01 g）试样置于 50 mL 塑料离心管中， 准确加入 10.0 mL 含 0.1甲酸的甲醇水溶液（3.7），混匀，加入陶瓷均质子两颗（调味油 试样除外），于旋涡混匀器上涡旋15 min，于 8000 r/min 离心 10 min，取 3 mL 提取液层溶 液过 0.45 μm 有机相滤膜后待净化。 净化准确移取1.0 mL 提取液（6.1.1）至固相萃取柱（3.15）中，依次用3 mL 0.1甲酸水 溶液（3.5）、3 mL 水、3 mL 甲醇淋洗固相萃取柱。用 6 mL 氨水甲醇溶液（3.10）洗脱目 标物，并收集洗脱液，洗脱溶液在45℃下，用氮气吹至近干，残渣用1.0 mL 0.1含酸的乙 腈水溶液（3.9）溶解（香辛料样液残渣用0.5 mL 溶解），过0.22 μm 有机相滤膜上机测定。 6.2仪器参考条件 a 色谱柱C18柱，4.6 mm100mm，粒径 3.5 m，或性能相当者。 b 流动相A 为 0.1甲酸水溶液（3.5） ，B 为乙腈（3.2） ，梯度洗脱程序见表2。 c 流速1.0 mL/min。 d 柱温35℃。 e 进样量10 μL。 f）激发波长550 nm；发射波长580 nm。 表 2 梯度洗脱程序 时间min Initial 流动相 A（） 65 流动相 B（） 35 0.1 6.0 6.5 8.0 10.0 65 30 30 65 65 35 70 70 35 35 6.3空白试验 除不加试样外，均按试样同法操作。 7结果计算 试样中罗丹明 B 的含量按式（1）计算获得 式中 X 试样中罗丹明B的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c 试样中罗丹明B峰面积对应的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V 试样定容体积，单位为毫升（mL）； m 称样量，单位为克（g）; 稀释因子。 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有 效数字。 8精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10。 9其他 当称样量为2 g（香辛料样品称取1 g）时， 本方法中罗丹明B的检出限为0.0025 mg/kg， 定量限为0.005 mg/kg； 液相色谱质谱确证法的检出限为0.0025 mg/kg， 定量限为0.005 mg/kg。 10确证实验 当试样中检出罗丹明B 时，可按附录 B 方法进行确证。 .（1） 附录 A 罗丹明 B 液相色谱图 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 mV Ex550nm,Em580nm 12 0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.0min 图 A.1 罗丹明 B 标准溶液色谱图（浓度5 ng/mL） 附录 B 罗丹明 B 确证实验 B.1. 液相色谱-质谱/质谱参考条件 a 色谱柱C18柱，1003.0 mm，粒径 1.7 m，或性能相当者。 b 流动