编制说明-检验检疫标准管理信息系统

沼泽红假单胞菌计数方法沼泽红假单胞菌计数方法 编制说明编制说明 一、任务来源和工作情况一、任务来源和工作情况 根据质检总局 2009 年 关于下达 2009 年度出入境检验检疫行业标准制 （修） 订计划的通知（国认科[2007]） 40 号文下达的编写任务通知 （计划号 2009B174） ， 由厦门出入境检验检疫局主要负责行业标准 沼泽红假单胞菌计数方法的起草 工作。 本标准是按照 GB/T 1.1-2000标准化工作导则 第一部分标准的结构和编 写规则的要求进行编写的。 本标准起草单位包括厦门出入境检验检疫局、集美大学、 厦门市农产品质检 中心、厦门大学。 本标准参考国内外有关权威文献，经大量实验验证后制定。 二、沼泽红假单胞菌的背景资料二、沼泽红假单胞菌的背景资料 沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）是一种光合细菌，它集生命 的四种不同代谢作用光能自养、光能异养、化能自养和化能异养于一身。该细 菌在自然界尤其是水体中有着广泛分布。 沼泽红假单胞菌在水产及家畜养殖、污 水处理、 食用色素提取等领域得到广泛应用。目前我国已有许多厂家生产光合细 菌菌剂。光合细菌种类繁多， 饲料添加剂品种目录（2008） 规定，沼泽红假单 胞菌是唯一可用于饲料的光合细菌。 NY 527-2002 光合细菌菌剂对菌剂中有 效活菌数进行了规定，但标准中所附检测方法无菌种鉴定步骤，无法确定检测的 光合菌是否为沼泽红假单胞菌。为了防止生产厂利用其它菌冒充沼泽红假单胞 菌，或者有效活菌数达不到标准要求，保护产品生物安全，保护消费者权益，制 定本标准。 根据最新伯杰氏系统细菌学手册第二版（Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, second edition） ，沼泽红假单胞菌属于细菌域（Bacteria）、变形菌 门Proteobacteria、 α -变形杆菌纲 （Alphaproteobacteria） 、 根瘤菌目Rhizobiales、 慢生根瘤菌科Bradyrhizobiaceae、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）。依据 分类学研究成果的积累， 手册对包括红假单胞菌属在内的许多菌种的分类地位进 行大幅度调整,本标准依据伯杰氏系统细菌学手册第二版对沼泽红假单胞菌 进行鉴定，手册中对该菌描述如下 沼泽红假单胞菌单个细胞呈杆状到卵形，偶尔轻微弯曲，0.6-0.91.2-2.0μm，以亚极 生鞭毛运动，营芽生繁殖。母细胞在位于鞭毛相反的一端产生一个细管， 管长为原来细胞的 1.52.0 倍。管的末端膨大，子细胞成长，产生一个哑铃状的菌体。然后发生不对称分裂。 年幼的单个细胞很会运动。 在老培养物亦个特征 单个细胞以鞭毛端相互连在一起， 形成玫 瑰状标识和簇。在某些复杂的培养基中，单个细胞可长达10μm，形状不规则。 光合膜象叶 一样出现在细胞膜下并与之平行；芽生细管中无叶状结构。细胞液的颜色为红色至棕红色。 活细胞在 375、468、493、520-545、589、802 和 860-875nm 处有吸收峰。光和色素为菌叶 绿素 a（被叶绿醇酯化）和正常的螺菌黄质系的胡萝卜。 在有少量酵母膏，以氢、硫化物和硫代硫酸盐作为电子供体营光能自养生活。 能以多种 有机物营光能异养生长。 在黑暗中微氧至厌氧环境出现化能生长。 厌氧环境中能发酵一些底 物。 硫酸盐可作为唯一的硫源。 氮源可以是氨、 四氧化二氮、 某些氨基酸或者对于几个菌株， 还可能是硝酸盐。所需的生长因子是对-氨基苯甲酸，而对某些菌株是生物素。酵母膏有显 著刺激生长的作用。 存在带 10 个异戊二烯单元的泛醌（Q-10） 中温淡水细菌，最适温度30-37℃，最适 pH6.9（pH 范围5.5-8.5） 沼泽红假单胞菌属于不产氧光能紫色细菌 （Anoxygenic Phototrophic Bacteria, 简称 APPB） 。该类细菌能在厌氧条件下通过光合作用生长，但不产氧。它们的 另一个主要特征是含有光依赖的菌绿素 a 或 b 和各种类胡萝卜素。APPB 在分类 上分属α -变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β -变形菌纲（Betaproteobacteria）、 γ -变形菌纲（Gammaproteobacteria） 。紫色非硫细菌（purple nonsulfur bacteria， 简称 PNSB） 隶属于α -变形菌纲和β -变形菌纲； 紫色硫细菌隶属于γ -变形菌纲。 紫色硫细菌在光合作用时需要还原性硫化物作为电子供体。 沼泽红假单胞菌属于 PNSB。 三、标准制定依据三、标准制定依据 由于是专一性分离鉴定一种菌，本标准采用先选择性增菌，可见生长后，再 用琼脂平板分纯，然后鉴定菌种的实验策略。 （一）培养基选择依据 本标准的选择性增菌培养基采用 Johannes F. Imhoff 教授在伯杰氏系统细 菌 学 手 册 及 Theprokaryotesahandbookonthebiologyof bacteriaProteobacteriaAlpha and Beta Subclasses 中推荐的AT培养基。（注 Imhoff 教授是当今光合细菌分类学领域的权威学者， 手册中光合细菌方面的首席编辑） 。 AT培养基适宜绝大多数 PNSB 生长。根据 Imhoff 教授推荐，苯甲酸特别适合作 为沼泽红假单胞菌选择性增菌的碳源。 故选择性增菌培养基配方中用苯甲酸钠代 替通用的乙酸钠，生长因子只添加沼泽红假单胞菌需要的对 -氨基苯甲酸和生物 素，得出 M-AT培养基（modified AT media） 。 光和细菌分离培养基是一款近年研制适合包括沼泽红假单胞菌在内多种光 合细菌快速生长的培养基。经实验证实，与多种常见培养基比较，沼泽红假单胞 菌在该培养基上长得快，2d 即可得到结果；且长得充分，得到的平板菌落数多。 （二）鉴定项目制定依据 1．根据伯杰氏系统细菌学手册介绍，隶属于 β -变形菌纲的 PNSB 有三 个属、5 个种，它们的一些特征如表 1 所示。 表 1. 光合营养的β -变形菌纲不同特征 菌种 特征 细胞形态 运动 粘液形成 颜色 利用苯甲酸 Rhodocyclus purpuresu 半圆到圆 紫色紫罗兰 至紫罗兰 ＋ RhodocyclusRubrivivax tenuisgelatinosus 弯曲杆菌 ＋ ＋ 棕红色或紫 色紫罗兰 直至弯曲杆菌 ＋ ＋ 棕色 Rhodoferax fernementans 弯曲杆菌 ＋ 桃棕色 Rhodoferax antarcticus 弯曲杆菌 ＋ 桃棕色 注绝大数菌株阳性；－绝大数菌株阴性 从表 1 可以看出，通过增菌液的苯甲酸利用、菌液和菌落颜色、菌落形态、 镜检等完全可以把沼泽红假单胞菌与光合营养的β -变形菌纲的细菌区分开。 2．根据伯杰氏系统细菌学手册介绍，隶属于 α -变形菌纲的 PNSB 分散 在三个目中红螺菌目（Rhodos