DB21_T 4043-2024 水产养殖用枯草芽孢杆菌培养技术规程

ICS 65.150 CCS B 50/59 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 40432024 水产养殖用枯草芽孢杆菌培养技术规程 Technical regulation for production of Bacillus subtilis for aquaculture 2024 - 10 - 30 发布 2024 - 11 - 30 实施 辽 宁 省 市场监 督 管理局 发 布 DB21/T 40432024 前 言 本文件是按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位辽宁省海洋水产科学研究院。 本文件主要起草人叶博、李石磊、赵振军、董颖、王旭达、王笑月、刘桂林、刘丹妮、张乾、曹 琛、高学文、刘煜珺。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号综合楼A座），联系电话 024-23447862。 文件起草单位通讯地址辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街50号），联系电话 0411-84671027。 I DB21/T 40432024 水产养殖用枯草芽孢杆菌培养技术规程 1 范围 本文件规定了水产养殖用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生产中所涉及的术语和定义、生产环境 和设备要求、培养基、菌液生产技术流程、指标检测和储运的相关技术内容。 本文件适用于水产养殖用枯草芽孢杆菌的生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 3095 环境空气质量标准 GB 3097 海水水质标准 GB 3838 地表水环境质量标准 GB 20287 农用微生物菌剂 GB/T 26428 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 3 术语和定义 GB 20287 、GB/T 26428 确立的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 枯草芽孢杆菌 bacillussubtilis 芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，一种需氧菌。菌体杆状，无荚膜，周生鞭毛，能运动。 可形成内生抗逆芽孢，芽孢呈椭圆或柱形，位于菌体中央或稍偏，形成芽孢后菌体不膨大。生长、繁殖 速度较快，菌落表面粗糙不透明，灰白色或微黄色。 3.2 初级菌种 the primary strain 由单菌落接种培养，并通过甘油冷冻或试管穿刺保藏的菌种。 3.3 一级菌种 the first class strain 初级菌种在固体培养基上活化后，挑取单菌落接种至试管装液体培养基中，振荡培养的菌种。 3.4 1 DB21/T 40432024 二级菌种 the second class strain 试管中的一级菌种，转接至三角瓶装液体培养基中，继续振荡培养的菌种。 4 生产环境和设备要求 4.1 生产环境 应符合如下条件 厂区空气质量达到GB 3095 中二类环境空气质量标准要求。 发酵生产用海水应符合GB 3097 中二类水质要求，发酵生产用淡水应符合GB 3838 中 III 类水 质要求，其他用水应符合GB 3838 中 IV 类水质要求。 发酵生产场地及发酵相关设施应符合安全、环保、消防等条件要求。 发酵生产场地需配置消毒灭菌设施。菌种储藏、无菌操作设备应与生产场地相对隔离并定期消 毒。 4.2 生产设备 采用不锈钢发酵罐或PE材质发酵桶，设备体积根据生产规模自定。 5 培养基 5.1 一般要求 培养基所使用的原材料应满足菌液生产要求，具体按GB 4789.28 的规定执行。对于首次使用的发 酵原料应通过摇瓶或小型发酵试验后再用于发酵生产。 5.2 种子培养基 初级菌种及一级菌种使用的种子培养基中应含有易被菌种吸收利用的碳氮源，营养丰富。种子培 养基见附录A中的A.1。 5.3 发酵培养基 二级菌种发酵培养基与扩大生产培养基相同，该培养基要求在保证菌种生长性能的同时，尽量采用 来源丰富、成本低廉、营养缓释的培养基原料，培养基中还应添加缓冲剂稳定pH值。发酵培养基见附 录A中的A.2。 5.4 固体培养基 用于枯草芽孢菌种分离、鉴定及活菌计数使用。固体培养基见附录A中的A.3。 6 生产技术流程 6.1 菌液生产流程 具体生产流程见附录B。 2 DB21/T 40432024 6.2 菌种要求 应满足如下要求 用于发酵的枯草芽孢杆菌应明确菌种来源的相关信息。 初级菌种使用前应先检测纯度与状态，可涂布固体培养基平板检查，枯草芽孢杆菌在固体培养 基上形成灰白色或微黄色，圆形或蔓延成波浪形、不规则形的菌落，其表面粗糙、不透明、边缘扩张。 具体方法按GB/T 26428 执行。 发酵罐接种前应检测上一级菌种的纯度和浓度，不应有杂菌污染，菌液浓度应达到1.0108 cfu/mL以上。 6.3 灭菌方法 种子培养基、发酵培养基、固体培养基、菌种培养器材、发酵罐等均需采用高压湿热灭菌，灭菌条 件为115℃121℃ , 0.1 MPa～0.15 MPa ，灭菌20 min～30 min 。灭菌后无菌操作取培养基染色镜检，无 微生物说明灭菌彻底。 6.4 接种方法 6.4.1 一级菌种接种 接种针经火焰灭菌,待冷却后沾取少量初级菌种，转接至装有种子培养基的三角瓶内，完成一级菌 种的接种，此过程在超净工作台内完成。 6.4.2 二级菌种接种 一级菌种转接至发酵罐时，三角瓶口和发酵罐接种口处需有火焰保护，保证无菌操作。同时发酵罐 应调节进排气阀，保持罐内正压。 6.5 发酵罐分批发酵参数 发酵参数设置如下 a 发酵罐装液量为 60～70； b 发酵温度为 35℃37℃ ; c 初始搅拌转速为 250 rpm～300 rpm； d 接种量为装液量的 2～5； e 初始