重组人胰岛素信息资料

CN1177928A [中文] 发明名称发明名称 -- -- 生产人胰岛素生产人胰岛素 申请号 申请日 公开（公告）号 公开（公告）日 IPC 分类号 申请（专利权）人 发明人 优先权号 优先权日 申请人地址 摘要摘要 [ [支持框选翻译支持框选翻译] ] CN94195231 1994.12.29 CN1177928A 1998.04.01 A61K38/28; C12N15/17 生物技术通用公司; JR哈特曼;S门德罗维茨;M戈雷基; 美国新泽西州; 简体中文简体中文--英文英文英文英文--简体中文简体中文其他语种其他语种 提供了改进且有效的通过折叠胰岛素原杂交多肽来生产重组人胰岛素的方法。 摘要附图摘要附图 发明名称发明名称 -- Generation of human insulin -- Generation of human insulin 申请号 申请日 公开（公告）号 公开（公告）日 IPC 分类号 CN94195231 1994.12.29 CN1177928A 1998.04.01 A61K38/28; C12N15/17; C12N15/16 申请（专利权）人 发明人 优先权号 优先权日 摘要摘要 [ [支持框选翻译支持框选翻译] ] BIO TECHNOLOGY GENERAL CORP; HARTMAN J R;MENDELOVITZ S;GORECKI M; CN94195231 1994.12.29 简体中文简体中文--英文英文英文英文--简体中文简体中文其他语种其他语种 Abstract An improved and efficient process for the production of recombinant human insulin by folding of a proinsulin hybrid polypeptide is provided. 摘要附图摘要附图 1.生产胰岛素的方法包括 a在允许形成正确二硫键的条件下，折叠含胰岛素原的杂种多肽； b使折叠的、二硫键键合的杂种多肽经酶促裂解以产生胰岛素； c纯化胰岛素。 2.根据权利要求 1 的方法， 其中步骤a还包括在约 pH8.5- 12.0，约 4-37℃将杂种多肽保温约 1-30 小时。 3.根据权利要求 2 的方法，其中在存在抗坏血酸的条件下进行保温。 4.根据权利要求 2 的方法，其中 pH 为 11.0-11.25。 5.根据权利要求 3 的方法，其中 pH 为 11.0-11.25。 6.根据权利要求 3 的方法，其中在折叠混合物中，抗坏血酸的浓度为每摩尔SH 基约 2 摩尔 抗坏血酸。 7.根据权利要求 2 的方法，其中所述保温时间为约5 小时。 8.根据权利要求 3 的方法，其中所述保温时间为约5 小时。 9.根据权利要求 1 的方法，其中步骤b还包括 I将 pH 调到约 8.8-9.0；和 ii在 16-37℃用胰蛋白酶和羧肽酶B 裂解杂种多肽 30 分钟-16 小时。 10.根据权利要求 1 的方法，其中步骤c还包括用 DEAE- Sepharose层析和 RP-HPLC 纯化。 11.根据权利要求 1 的方法，其中步骤c还包括用超滤和 CM -Sepharose层析纯化。 12.根据权利要求 1 的方法，其中步骤c还包括用 DEAE- Sepharose 层析和苯基-Sepharose 层 析。 13.根据权利要求 1 的方法，其中用 ATCC保藏号为 69361 的质粒 pDBAST-LAT表达胰岛素原 杂种多肽。 14.根据权利要求 1 的方法，其中用ATCC保藏号为 69363 的质粒 pλ BAST-LAT表达胰岛素原 杂种多肽。 15.根据权利要求 1 的方法，其中用ATCC保藏号为 69362 的质粒 pBAST-LAT表达胰岛素原杂 种多肽。 16.根据权利要求 1 的方法，其中通过处理含编码杂种多肽之 DNA 的细菌细胞，以便 DNA 指导所述多肽的表达，从而得到步骤a 的杂种多肽。 17.根据权利要求 16 的方法，其中从所述细胞中回收杂种多肽。 18.根据权利要求 16 的方法，其中所述处理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的条件下发酵。 19.根据权利要求 17 的方法，其中所述回收包括 I破坏所述细菌细胞的细胞壁或其片段以产生溶胞产物； ii通过离心从溶胞产物中分离细胞内沉淀物；和 iii增溶所述沉淀物。 20.含有胰岛素原和与所述胰岛素原的 N-末端相连的前导肽的多肽，其中所述多肽被折叠并 含有正确的二硫键。 21.根据权利要求 20 的多肽，其中所述前导肽衍生于CuZnSOD 的 N-末端。 22.根据权利要求 21 的多肽，其中所述前导肽含有 62 个氨基酸，其前为氨基酸 Met，其后 为 Arg 残基。 23.根据权利要求 20 的多肽， 其中所述胰岛素原含有通过单Arg 残基与胰岛素 A 链共价相连 的胰岛素 B 链。 24.根据权利要求 20 的多肽，其中所述胰岛素原含有通过二肽 Lys-Arg残基与胰岛素 A 链共 价相连的胰岛素 B 链。 25.根据权利要求 20 的多肽，其中前导肽的Cys 残基已经被 Ser 残基所取代。 说明书 生产人胰岛素 这是美国系列申请 08/175298，1993 年 12 月 29 日申请的接续申请。 发明背景 在本发明说明书中，用括号内的阿拉伯数字列出了各种文献。 在说明书后，权利要求前可以 找到这些参考文献的所有引述。 将这些文献公开的所有内容均引入本说明书作为参考以便更 全面地描述本发明所涉及的现有技术的状态。 胰岛素是控制葡萄糖代谢所必需的多肽激素， 每天施用给患糖尿病的患者， 糖尿病是胰岛素 供应不足而引起的代谢紊乱。 体内，首先将该激素合成成长前体分子，随后加工成由 A 和 B 链组成的其生物活性形式。 更详细地说，在内分泌胰腺的β 细胞内，将前原胰岛素的基因转录成 mRNA 前体，然后剪 接生产成熟 mRNA。将所述 mRNA 翻译成前原胰岛素NH2-前区-B 链-C 肽-A 链- COOH，接着 再加工成胰岛素原并最终加工成胰岛素。 该过程的第一步就是蛋白水解除去前区， 该区是通 过内质网的微粒体膜来转移新链的疏水信号序列。在人前原胰岛素中，前区的长度是24 个 氨基酸。 在胰岛素原中， 将变成成熟胰岛素的多肽链的两个区， B-和A 链通过C肽或C-链彼此相连， 所述C肽在N和C末端含有两对碱性氨基酸。 在大多数C肽中， 这些配对是Arg-Arg和Lys-Arg。 人 C 肽，包括两个侧对的碱性氨基酸，含有35 个氨基酸。C 肽与所述多肽的两个部分相连 以便有助于在 B 和 A 片段之间形成二硫键。因此， C 肽的作用很大程度上不依赖其结构。 事实上，用较短的合成桥键代替仍能适当地折叠胰岛素原分子1，2。 胰岛素原折叠， 同时发生两个链间二硫键和一个A 链二硫键的氧化。 在成熟化的最后阶段， 蛋白水解酶在碱性氨基酸处裂解以释放 C 肽并形成成熟胰岛素3。在人胰岛素中，A 链有 21 个氨基酸，