沙门氏菌检验

沙门氏菌检验 范围 1.本法适用于食品中沙门氏菌的检验。 2. 设备和材料 处微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下 2.1 冰箱2℃～5℃。 2.2 恒温培养箱36℃1℃，42℃1℃。 2.3 均质器。 2.4 振荡器。 2.5 电子天平感量 0.1g。 2.6 无菌锥形瓶容量 500mL，250mL。 2.7 无菌吸管1mL（具 0.01mL 刻度） 、10mL（具 0.1mL 刻度）或微 量移液器及吸头。 2.8 无菌培养皿直径 90mm。 2.9 无菌试管3mm50mm、10mm75mm。 2.10 无菌毛细管。 2.11pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 2.12 全自动微生物生化鉴定系统。 3. 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（BPW） 。 ）增菌液。TTB 四硫磺酸钠煌绿（3.2． 3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。 3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂。 3.5HE 琼脂。 3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。 3.7 沙门氏菌属显色培养基。 3.8 三糖铁（TSI）琼脂。 3.9 蛋白胨水、靛基质试剂。 3.10 尿素琼脂（pH7.2） 。 3.11 氰化钾（KCN）培养基。 3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基。 3.13 糖发酵管。 3.14 邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）培养基。 3.15 半固体琼脂。 3.16 丙二酸钠培养基。 3.17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。 3.18 生化鉴定试剂盒。 4.4. 检验程序检验程序 沙门氏菌检验程序见图 1。 检样 36℃1℃，18h～ 24h 25g（mL）样品 36℃1～℃，℃42118h24h ℃，18h～24h 1mLSC10mL 1mLTTB10mL 36℃1℃，40h～48h 36℃1℃，18h～24h 1 1 沙门氏菌检验程序图沙门氏菌检验程序图操作步骤操作步骤 5.5. 前增菌前增菌 5.15.1 称取 25g（mL）样 品放入盛有 225mLBPW 的无菌均质杯中，以 8000r/min～10000r/min 均质 1min～2min，或置于盛有225mLBPW 的无菌均质袋中，用拍击式 均质器拍打 1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。 如需测定 pH 值，用 1mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.80.2.无 菌操作将样品转至 500mL 锥形瓶中， 如使用均质袋， 可直接进行培养， 于 36℃1℃培养 8h～18h。 如为冷冻产品，应在 45℃以下不超过 15min，或 2℃～5℃不超过 18h 解冻。 5.25.2 增菌增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物， 移取 1mL， 转种于 10mLTTB 内， 于 42℃ 1℃培养 18h～24h。 同时， 另取 1mL 转种于 10mLSC 内， 于 36℃1℃ 培养 18h～24h。 5.35.3 分离分离 分别用接种环取增菌液 1 环， 划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板） 。与 36℃ 1℃分别培养 18h～24h（XLD 平板、HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色 培养基平板） 或 40h～48h （BS 琼脂平板） ， 观察各个平板上生长的菌 。 1 落，各个平板上的菌落特征见表． 表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌 菌落为褐色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可成黑色或棕色；有些琼脂 BS 菌株成灰绿色的菌落，周围培 养基不变。 HE 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。 XLD 琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌 株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定。 5.45.4 生化试验 5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可以菌落，接种 三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接 接种懒氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃1℃培养 18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验 培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。 表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内的反应 结果 三糖铁琼懒氨酸脱羧酶试验培养初步判 斜底产硫化可疑沙门氏菌K＋（－A＋（－ ＋（－＋（－KA 可疑沙门氏菌＋（－可疑沙门氏菌＋（－AA ＋A /－ 非沙门氏菌 ＋－ /－A ＋K 非沙门氏菌/－＋/ K －/－ ＋注K产碱，A产酸；＋阳性，－阴性；＋（－） 多数阳性，少数阴性；＋/－阳性或阴性。 5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接 种蛋白胨水（供做靛基质试验） 、尿素琼脂（pH7.2） 、氰化钾（KCN） 培养基， 也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接判 定 3，按表 48h，必要时可延长至 24h～18h℃培养 1℃36 种。于 结果。将已挑菌落的平板储存于 2℃～5℃或室温至少保留 24h，以备 比必要时复查。 表表 3 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢（ A1 A2 HS） ＋ ＋ A3－ 注＋阳性；－阴性；＋/－阳 性或 阴性。 靛基 pH7.尿氰化钾 KC 懒氨酸脱羧 反应序号 A1典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、 KCN 和懒氨酸脱 羧酶 3 项中有 1 项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。如有 2 项异常为 非沙门氏菌。 表表 4 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH7.2 尿素 氰化钾（－ －KCN） 懒氨酸脱羧酶 判定结果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） － 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特征）－ ＋ ＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） ＋－＋ 注＋表 示阳性； －表示 阴性。 醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性， 但需要结 合血清学鉴定结果进行判定。 隐形为沙门氏菌，同事赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖 氨酸脱羧酶阴性。 表表 5 5 沙门氏菌属生化群的鉴别沙门氏菌属生化群的鉴别 项目 卫矛醇 山梨醇 Ⅰ ＋ ＋ Ⅱ ＋ ＋ Ⅲ Ⅳ Ⅴ ＋－－ ＋＋ ＋ Ⅵ － － － 水杨苷－ － － ＋ － － ONPG －－＋－＋ － － － ＋ ＋ － 丙二酸盐． KCN －－－＋＋－ 注＋表示阳性； －表示阴性。 5.4.3 或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.55.5 血清学鉴定血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备抗原的准备 一般采用 1.2～1.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 O 血清不凝集时，讲菌株接种在琼脂量较高的（如2～3）培养基上 再检查；如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取 菌苔于 1mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。 H 抗原发育不良时， 将菌株接种在 0.55～0.65