医学毕业论文p38丝裂原活化蛋白激酶在大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的磷酸化及其意义

XX大学 毕业论文 P38丝裂原活化蛋白激酶在大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的磷 酸化及其意义 姓 名 2014年6月25日 p38丝裂原活化蛋白激酶在大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的磷酸化及其意义 【摘要】 目的观探讨大鼠视网膜缺血再灌注损伤后p38丝裂原活化蛋白 激酶p38 MAPK的磷酸化及其意义.方法采用升高眼内压的方法，制作实 验性视网膜缺血再灌注大鼠模型.将30只Wistar大鼠随机分为正常组n6和 缺血再灌注组n24,其中缺血再灌注组又分为再灌注后2, 12, 24, 72 h等4 个时间段每时间段6只.应用Western Blot法检测视网膜组织中p38 MAPK 及磷酸化p38 MAPK p p38 MAPK蛋白的表达变化.结果p38 MAPK在 缺血再灌注组各时间点的视网膜组织内的表达保持相对恒定，与正常对照组相比 无统计学上的变化P0.05 . p p38 MAPK的表达水平在缺血再灌注组12 h时 即有明显升高，24h时达到高峰，72 h时仍维持较高的表达水平，与正常对照组 相比有统计学著差异P0.01.结论p38 MAPK信号通路的激活可能与缺血 再灌注所造成的视网膜损伤有密切关系. 【关键词】视网膜；再灌注损伤；p38丝裂原活化蛋白激酶类；印迹法，蛋 白质；大鼠 0引言 视网膜缺血再灌注retina ischemia reperfusion injury损伤主要发生在视 网膜动静脉阻塞、未成熟的视网膜病变、糖尿病性视网膜病变等视网膜血管阻塞 所致的缺血性疾病中，它们均可造成不同程度的视网膜缺血.在缺血再通后，视 网膜反而受到更为严重的损伤，造成视功能下降[1- 2].因此，加强对视网膜 缺血再灌注损伤机制的研究是非常重要的.目前视网膜缺血再灌注损伤的机制 尚未完全阐明，本实验通过建立大鼠的视网膜缺血再灌注损伤模型，观察丝裂原 活化蛋白激酶mitogen activated protein kinase, MAPK家族成员之一的 p38 MAPK蛋白在缺血再灌视网膜中的表达以及其磷酸化的时相变化，探索p38 MAPK在视网膜缺血再灌注损伤中的可能作用，为临床治疗视网膜缺血再灌注 损伤类疾病提供理论依据. 1材料和方法 1.1材料成年健康Wistar大鼠30只，第四军医大学实验动物中心提供.雌 雄不拘，体质量270-300 g,室温环境饲养.小鼠抗p38 MAPK及小鼠抗磷酸化 p38MAPK （p p38 MAPK）单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；山羊抗p actin 多克隆抗体购自美国Chemicon公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或 山羊二抗购自Chemicon公司；ECL化学发光试剂盒、PVDF膜购及Hyperfilm 胶片自美国Amersham公司；蛋白质提取及浓度测定试剂盒购于美国BioRad公 司. 1.2方法 1.2.1视网膜缺血再灌注模型的建立动物随机分成两组正常对照组（6只） 和缺血再灌注组（24只）.缺血再灌注组又分为再灌注后2, 12, 24, 72 h等4个 时间段（每时间段6只大鼠）.以前房灌注升高眼压的方法制备大鼠视网膜缺血. 再灌注损伤模型，具体方法为大鼠以水合氯醛麻醉（400 mg/kg）,将生理盐水 瓶连接输液器，升高输液瓶至于大鼠眼垂直距离为150 cm左右处，灌注压力达 到110 mm Hg （14.63 kPa）,将连接输液器的7号头皮针自大鼠额侧角膜缘穿刺 入前房，手术显微镜直视下可见灌注压平衡后，视网膜苍白水肿，表明视网膜中 央动脉供血已被完全阻断.60 min后降低液瓶高度至27 cm以下（20 mm Hg）,此 时可见视网膜变红，表明视网膜血管重新开放，已形成再灌注.此时拔出前房灌 注针头，再灌注计时开始. 1.2.2视网膜内p38MAPK和p p38MAPKA的检测① 视网膜组织蛋白质 的提取正常对照组动物及再灌注后第2, 12, 24, 72 h的动物以水合氯醛麻醉， 快速取双侧眼球，分离出视网膜，液氮中速冻.加入裂解缓冲液（0.15 mol/LNaCl, 0.05 mol/LTris, 0.1 mg/L SDS, 0.1 mg/L 苯甲磺酰氟，1 p.g/L 抑蛋白酶肽，1 mg/L NP 40.匀浆，冰上裂解30 min, 4C 12000 g离心20 min,吸上清，-70C保 存.②蛋白质SDS PAGE及电转印用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，取 20 pig蛋白，进行125 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳.电泳结束后，用BioRad半干 电转移装置将蛋白质转印至PVDF膜，用含50 mg/L脱脂奶粉的PBST溶液0.2 mmol/L PBS, 0.02 g/L吐温20封闭，室温2 h.③ Western Blot检测分别加 入 p38 MAPK 1 2000, p p38 MAPK 1 2500和 p actin 1 5000 抗体，室温过夜.PBST洗膜，10minx3次，再加入HRP结合的羊抗小鼠IgGl 5000或驴抗山羊IgG 1 5000,室温孵育2 h. PBST洗膜后，加入ECL显色 剂，置暗室曝光.曝光后的胶片进行显影、定影，用UVP凝胶成像系统对胶片 上的条带进行扫描分析. 统计学处理用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测量，测得的p38 MAPK和p p38MAPK阳性条带的密度与相应的。actin条带密度的比值作为 其蛋白的相对表达量，采用SPSS10.1分析软件对实验数据进行方差分析以及两 两比较的Dunnett t检验. 2结果 Western blot显示，在正常大鼠视网膜中检测到了 p p38 MAPK, p38MAPK和p actin蛋白的表达，其中p38 MAPK和 actin有较高的表达水 平，而p p38 MAPK仅有微弱的表达图1.作为内参照的p actin在正常海 马组织和缺血再灌注后不同时间点的视网膜中的表达水平相当，表明在实验中所 加的蛋白量基本一致.p38 MAPK在缺血再灌注组各时间点的视网膜内的表达保 持相对恒定，与正常对照组相比差异无统计学意义P0.05 . p p38 MAPK的 表达水平在再灌注后2h时有轻度增加，但与正常对照组相比无显著差异.其表 达水平在再灌注12 h时明显升高，24 h时达到高峰，72 h时仍维持较高的表达 水平，与正常对照组相比有统计学差异P0.01,分别是其在正常组海马组织中 表达水平的3.9, 5.8和3.4倍图1,2. 图1正常对照组（C）和缺血再灌注后不同时间点大鼠视网膜内p p38 MAPK, p38 MAPK和 actin蛋白的表达（略） bPO.Ol vs正常对照. 图2正常对照组和缺血再灌注后不同时间点大鼠视网膜内p p38 MAPK 和p38 MAPK蛋白的相对表达水平（略） 3讨论 视网膜缺血再灌注损伤是眼科临床很常见的病理生理过程.由于供应视网 膜血液的中央动脉为终末动脉，因此视网膜缺血及循环障碍，