医学毕业论文hurat1基因真核表达重组体的构建及意义

XX大学 毕业论文 hURATl基因真核表达重组体的构建及意义 姓 名 2014年6月25日 hURATl基因真核表达重组体的构建及意义 【摘要】 目的构建pcDNA3.1-/hURAT 1真核表达重组体。方法 提取人全 血基因组DNA,进行PCR扩增，将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1-连 接后转化DH5a感受态细胞。重组质粒经BamH I和EcoR I酶切后，应用核昔 酸序列测定方法进行鉴定。结果PCR扩增得到hURATl第2外显子至第5内含 子长1 958 bp的基因片段。该片段与表达载体pcDNA3.1-连接后转化DH5a感 受态细胞。重组质粒经酶切和核昔酸序列测定方法鉴定，证实hURATl片段插 入序列和方向正确。结论hURATl基因组DNA片段插入真核表达载体 pcDNA3.1-的序列和方向正确，可用于后续基因功能研究，尤其是编码序列和 内含子序列变异的功能研究。 【关键词】人尿酸盐转运子1； pcDNA3.1-；基因；克隆，分子；内含子； 高尿酸血症 [ABSTRACT] Objective To construct the recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1 -/hURAT 1. sTotal genome DNA was prepared from normal human total blood. DNA was then subjected to PCR amplification. PCR product was cloned into pcDNA3.1- and then the recombinant vector transed into DH5a Ecoli. Constructed pcDNA3.1 -/hURAT 1 was identified by restricting enzyme digestion analysis and DNA sequencing. Results A 1 958 bp fragment, including exon 2 to intron 5 of hURATl genome DNA, was obtained by PCR amplification. BamH I and EcoR I restriction enzyme digestion and DNA sequencing confirmed with the correct sequence and direction. The pcDNA3.1 -/hURAT 1 had been successfully constructed. Conclusion The fragment of hURATl with correct sequence and direction is cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1-, and it can be applied to gene function research in the future, especially to the mutation function research in the CDS or intron. [KEY WORDS ] hURAT 1; pcDNA3.1-; Gene; Cloning, molecular; Introns; Hyperuricemia 人尿酸盐转运子1 hURATl是维持血尿酸水平的关键离子通道，是原 发性高尿酸血症和痛风的重要候选基因，其基因变异与原发性高尿酸血症和痛风 发病密切相关［1］。其基因位于llql3,含有10个外显子和9个内含子，cDNA全 长2 642 bp,编码区长1 659 bp,编码555个氨基酸［2］。Pubmed SNP检索结果 显示，大多数SNP位点位于第2外显子与第5内含子之间，共78个，其中相当 数量SNP位点位于内含子区域，而且与尿酸代谢异常高度相关［25］。然而，国 内外相关研究均为关联性研究和基因编码序列的功能研究，缺乏内含子功能研 究。hURATl mRNA主要在人肾小管上皮细胞中特异性表达，临床上得到含有待 研究SNP位点肾脏标本的概率很小，所以体外重组体的构建及其在真核细胞中 的表达成为研究hURATl基因突变或SNP影响基因转录或翻译的主要手段。本 文应用PCR方法对hURATl第2外显子至第5内含子之间基因组DNA序列进 行扩增，然后克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）,构建pcDNA3.1（-） / hURATl 重组体，为今后研究该基因变异对表达的影响奠定基础，从而可以进一步解释 hURATl与尿酸代谢异常之间的关系。 1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器 基因组DNA提取试剂盒（TAKARA公司）、KOD DNA聚合酶（TOYABO 公司）、QIAquick Gel Extraction Kit （ QIAGEN 公司）、pGEM T Easy Vector（PROMEGA 公司）、T4 DNA 连接酶（PROMEGA 公司）、胰蛋白豚 （SANGON公司）、酵母提取物（SANGON公司）、琼脂（SANGON公司）、氨 节青霉素（SANGON公司）、限制性内切酶（FERM ENTAS公司）、pcDNA3.1（-） Vector（INVITROGEN公司）、DH5a感受态细胞（TIANGEN公司）、质粒小规模 抽提试剂盒（AXYGEN公司）、质粒中规模抽提试剂盒（QIAGEN公司）。 PTC 225型高通量PCR仪（MJR公司）、UVP凝胶成像仪（BIORAD公司）、 MIR262恒温孵箱（SANYO公司）、低温离心机（EPPENDORF公司）、Bio RAD 电泳仪（BIORAD公司）、DU 650型紫外线分光光度计（EPPENDORF公司）、 超净工作台（Class Biological Safety Cabinet II, BAKER 公司）。 1.2 PCR扩增 按照基因组DNA提取试剂盒说明提取正常人全血DNAo以Gene Bank公 布的hURATl基因组DNA序列为模板，并根据所要构建的表达载体要求在5 和3,端引入BamH I和EcoR I酶切位点，扩增包含第2外显子至第5内含子在 内的一段序列。所有引物由上海生工生物技术有限责任公司合成见表1。应用 多重PCR方法，首先扩增片段①，使用1FBAMH和1R作为引物，扩增条件 94 C预变性 5 min； 94 C变性 40 s, 66 C退火 40 s, 68 C延伸 1 min30 s, 35 个循环；68 C终延伸lOmino其次扩增片段②，使用2F和2RECOR引物，扩 增条件94 C预变性5 min； 94 C变性40 s, 68 C退火40 s, 68 C延伸50 s, 35个循环；68 C终延伸10 mino最终以片段①和片段②PCR产物1