医学毕业论文降钙素基因相关肽对培养心肌细胞作用的实验观察

XX大学 毕业论文 降钙素基因相关肽对培养心肌细胞作用的实验观察 姓 名 2014年6月25日 降钙素基因相关肽对培养心肌细胞作用的实验观察 【关键词】，降钙素基因相关肽 关键词降钙素基因相关肽;心肌细胞;细胞毒性;细胞培养 摘要目的 探讨降钙素基因相关肽CGRP对心肌细胞的毒性作用.方 法 将原代培养成活4d后的大鼠心肌细胞分为4组，A组为对照组，B, C, D3 组分别加入 CGRPlxlO-9 , 1x10-8 和 1x10-7 molL-1 .实验开始后 0.5, 1.0, 1.5 及2.0h评定心肌细胞搏动功能，观察细胞酶、培养液中电解质变化及形态学变 化.结果B, C, D组各时点搏动频率均较A组各时点加快，D组在2.0h细胞 呈部分或无搏动，随剂量递增及作用时间延长，细胞形态学略有变化，但不明显. 乳酸脱氢酶，天冬氨酸转氨酶，肌酸激酶和a-羟丁酸脱氢酶释放量、电解质含量 及CO2含量均未见显著改变.结论 CGRP在低浓度1x10-9 ,1x10-8 molL-1 时呈正性变时、变力作用;高浓度大于1x10-7 molL-1 时呈现一定的抑制作 用. AbstractAIM To investigate CGRP cardiotoxicity profile.S Four day-old spontaneously contracting neona-tal primary myocardial cell cultures obtained from2-to3-day old Wistar rats were divided into4groups, group A as control and group B, C, and D treated with CGRPlx 10-9 , 1x10-8 andl10-7 molL-1 respectively fromO. 5to2. Oh.The contractility, morphology, cytoplasmic enzyme LDH, AST, CK and HBD release content of myocardial cell, the concentration of electrolytes K , Na , Ca2 and Cl- in the medium and the content of CO2 were measured0.5, 1.0, 1.5and2.0h following CGRP administration.RESULTS In group B, C and D the beating rates of myocardial cell cul-tures increased compared with group A.The cells showed partly beating or no beating at2.0h in group D, and the changes on morphology were in a concentration and time-de-pendent manner, but were not significant.Cytoplasmic en-zymeLDH, AST, CK and HBDrelease content of myocar-dial cell, the concentration of electrolytes K , Na , Ca2 and Cl- and the content of CO2 showed no significant changes.CONCLUSION Lower concentrations of CGRP 1x10-9 , 1x10-8 molL-1 have positive chronotropic and in-otropic effects, while high concentrations of CGRP 1x10-7 molL-1 show some inhibitive action. 0引言 降钙素基因相关肽calcium gene-related pep-tide, CGRP是一种内源性 生物活性多肽，对心血管系统的活动具有调节作用.我们用大鼠心肌细胞原代培 养法进行体外研究，旨在探讨CGRP对心肌细胞的作用. 1材料和方法 1.1心肌细胞的制备与培养[1, 2]取2〜3日龄Wistar大鼠，雌雄不 拘由我校实验动物中心提供，无菌条件下摘取心室，用10gL-l胰蛋白酶磷 酸盐缓冲液pH7.4在磁力搅拌40rmin-l 下分散细胞，lOmin后改用2gL-l 胰蛋白酶液重复2次，再用O.lgL-1胶原酶磷酸盐缓冲液pH7.4消化4次， 弃去前2次细胞悬液，后5次细胞悬液离心后弃去上清液，将沉淀物合并混悬于 lOmLDMEM培养基Gibco,美国中行细胞计数，以每孔1106细胞密度接 种于含100mLL-l小牛血清DMEM培养基的24孔板培养液中，于37CCO2培 养箱中培养. 1.2实验分组与药物处理 培养成活4d后的心肌细胞更换无血清培养液 并分成4组，每组12孔.A为对照组，B, C, D组分别加入1x10-9 , 1x10-8和 1x10-7 molL-1的CGRP.每组再分4个亚组，分别于实验开始后0.5, 1.0, 1.5及 2.0h终止反应. 1.3心肌细胞搏动功能评定[3] 于倒置显微镜下每孔随机选择3个细 胞簇，用细胞搏动正常、部分搏动SB、无搏动NB及细胞破坏来评定心 肌细胞搏动功能. 1.4细胞形态学观察[3]倒置显微镜下观察心肌细胞胞质内空泡、颗 粒及细胞膜伪足的变化，终止反应时，用无血清培养液洗涤2次，2.5gL-l胰酶 消化后，置锥形离心管中2OOrmin-1离心lOmin〜20min,沿管壁倒入20gL-l戊 二醛2mL,固定2.0h后送我校电镜室常规处理、观察. 1.5心肌细胞酶代谢及培养液电解质测定[3] 终止反应各时间点，取 各亚组培养液离心后，用全自动生化分析仪（GEMSTAR,美国）测定上清液中 乳酸脱氢酶（LDH）,天冬氨酸转氨酶（AST）,肌酸激酶（CK）和a-羟丁酸脱 氢酶（HBD）的活力，并用电解质分析仪（GEMSTAR,美国）测定K , Na , Ca2 , Cl-及CO2的含量. 统计学处理以x 土s表示，行t检验和配对t检验.2结果 2.1心肌细胞搏动功能变化与对照组（A组）相比，B, C, D组各时点 搏动频率均明显加快，但随着药物作用时间的延长，D组搏动频率变慢，部分细 胞出现部分搏动或无搏动（Tabl）. 表1 CGRP对大鼠培养心肌细胞搏动频率及形态学的影响 略 2.2心肌细胞形态学变化 A组心肌细胞呈多角型，胞质内颗粒丰富，表 面伸出大量微突起，并有较长的伪足与周围细胞相连，B, C组与A组相似，D 组早期有空泡形成，颗粒及伪足减少，随作用时