基因表达研究技术

1、基因表达系列分析技术Serial Analysis of Gene Expression, SAGE 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核昔 酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析 所对应基因的表达频率。 2、原位杂交In Situ Hybridization, ISH是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测 体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为 RNA原位杂交和染色体原位杂交。 3、RNA原位杂交用放射性或非放射性如地高辛、生物素等标记的特异性探针与被固 定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA,可 通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。 4、荧光原位杂交fluorescence in situ hybridization, FISH.首先对寡核背酸探针做特殊的修饰 和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相 耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 5、基因定点突变site-directedmutagenesis.通过改变基因特定位点核昔酸序列来改变所编码 的氨基酸序列，用于研究某个些氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能 力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 6、基因敲除gene knock-out又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重 组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定 遗传等特点。 7、基因敲除分为 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性 条件型基因敲除又称不完全基因敲除，是指通过定位重组系统实现特定时间和空间 的基因敲除。 8、酵母单杂交系统Yeast one-hybridsystem是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋 白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白 的编码基因。将已知顺式作用元件构建到最基本启动子minimal promoter, Pmin的上游， 把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与己知酵母转录激活结构域 transcription-activating domain,AD融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与 顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。 9、酵母双杂交系统Yeast two-hybrid system真核生物转录调控因子具有组件式结构 modular特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构 域binding domain, BD和转录激活结构域activation domain, AD是转录激活因子发 挥功能所必须的。BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因 子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 10、Far Western印迹技术用32P标记的体外表达蛋白作探针，直接检测与该蛋白发生相互 作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。 11、GST融合蛋白沉降技术利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋 白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 12、蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的 探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检 测到稳定的相互作用蛋白点。 14、等离子表面共振技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。 当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使 金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。 15、免疫共沉淀技术将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用 的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用 下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 16、荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件 （1）给体与受体在合适的距离（1〜10nm）； （2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）； （3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有 一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据 需要组成不同的探针对。 17、RNAi （RNAinterference,RNA干涉）RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细 胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于 安德鲁法尔1998年在自然杂志上的论文。研究发现，双链RNA是RNAi的触发物， 引发与之互补的单链RNA （ssRNA.single-stranded RNA）的降解。经过Dicer （一种具有 RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA （30个核昔酸以上）首先被降 解形成21〜25个核昔酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA, short interfering RNA）,并有效地 定位目标mRNA。siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介， 它具有特殊的结构特征，即5端磷酸基团和3端的羟基，其两条链的3端各有两个碱 基突出于末端。由siRNA中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC） 的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实 现干扰靶基因表达的功能。 18、基因芯片（DNAchip）又称DNA微阵列（D NA microarray）技术是能同时监测大量靶 基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录 本的变化规律。 把大量己知或未知序列的DNA片段点在尼龙膜或玻璃片上，再经过物理 吸附作用达到固定化。也可以直接在玻璃板或金属表面进行化学合成，得到寡聚核昔酸芯片。 将芯片与待研究的cDNA或其他样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到成 千上万个基因在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达模式。 19、利用酵母鉴定靶基因功能 酵母菌是单细胞真核生物，具有与动植物细胞相似的结构特征。 酿酒酵母有稳定的单倍体和二倍体细胞，是最早完成基因组DNA全序列测定的真核生物。 导入酵母细胞中的DNA即能以自主复制的分子形式存在,也可被整合到基因组的方式存在o 酵母中转化