糖原的显示一PAS反应

糖原的显示一PAS反应 一、实验目的 掌握显示细胞中多糖成分的PAS反应的原理和方法； 了解多糖成分在细胞中的分布和相对含量。 二、实验原理 糖原由D-葡萄糖的分支或直链组成，在肝和肌肉最丰富。过碘 酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成二 个游离醛基（一CHO）,游离醛基与Schiff s试剂反应生成紫红色 产物，颜色深浅与多糖含量成正比。 单糖在固定、脱水和包埋等组织化学操作过程中被抽提掉，能显 示的糖类主要是多糖，包括糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白和糖脂等 因此要确定此红色物质是否糖原还需要同时进行对照实验。糖原可被 唾液淀粉酶水解，先用唾液淀粉酶作用再进行PAS显色，若反应为阴 性，则表明是糖原，反之则为其他多糖。 三、实验用品 器材盖玻片、载玻片、染色缸等 试剂1过碘酸溶液；Schiff s试剂，亚硫酸，Carnoy试剂， 甲醇，苏木精等 材料鲫鱼（鲫鱼血细胞） 四、实验步骤 1、取鲫鱼血制作血涂片，室温晾干 2、Carnoy （3甲醇1冰乙酸）固定（15分钟） 3、蒸俺水温和洗涤一次（1分钟） 4、0. 5过碘酸溶液侵泡10-15分钟 5、蒸俺水洗涤1分钟 6、亚硫酸洗涤1分钟 7、Schiff试剂浸泡15分钟 8、取出亚硫酸水溶液冲洗3次，每次1分钟 9、蒸馋水洗涤一次（1-2分钟） 10、光学显微镜下镜检 注对照片的设置 为了确保实验结果的可信性，在实验中需设置阴性对照片。 对照片预先用唾液淀粉酶37笆水解30-60分钟，取出后水洗， 再入过碘酸处理。 五、注意事项 1、涂片时不应吸取过多血液，在用固定剂固定之前应确保玻片 上的血样已经干燥，以免细胞脱落。 2、用蒸馋水洗涤时，水速不应太快，时间也不宜过长，以免细 胞吸水过多而导致涨破。 3、由于一个染色缸中要放置一组的玻片，在染色缸中进行各种 操作时，应将两块玻片背对背放置，并记住各自的朝向，以免损伤以 固定的细胞。 4、亚硫酸水要现配，配法如下10偏重亚硫酸钠5ml, lmol/1 HCL 5ml,蒸馅水 100mlo 六、结果分析及思考 1、绘图表示PAS反应的染色结果，并分析。 实验结果如上图所示，细胞质中可稍稍看到被染成紫红色的糖 原，原因就是细胞内葡萄糖中乙二醇基（CH0H-CH0H）被过碘酸氧化 成二个游离醛基（一CH0）,与Schiff s试剂反应生成紫红色产物。 2、思考细胞中其它组分如脂类，核酸，蛋白质，酸性磷酸酶的 检测。 脂类某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特 定的颜色反应。脂肪可以被苏丹III染液染成橘黄色（或被苏丹IV染 液染成红色）。酒精能够溶解苏丹III染液，故用它来洗掉浮色。 核酸方法一细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的 DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的 核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有 选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的 RNA呈红色。由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量 分析。 方法二DNA经lmol/L盐酸水解，其上的喋吟碱和脱氧核糖之 间的键打开、使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基 与Schiff试剂反应oSchiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠作用， 形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物。 因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应 有产物的分子内含有醍基，醍基是一个发色基团，所以具有颜色。 蛋白质由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目 不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。 如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正 电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸 后，用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋 白质显示出来。 酸性磷酸酶分解磷酸脂而释放出磷酸基。在PH5. 0的环境中， 磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅。但磷酸铅是无色的，所以再与硫化铛 作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内 的存在与分布。 七、实验感受 该实验与DNA的细胞化学Feulgen反应一样，应当注意每一 步的实验时间，否则就会出现细胞全部胀破情况出现，用显微镜观察 时只能看到细胞核的情况。虽然自己做得实验细胞没有被胀破，但是 染色并不是很明显，说明染色时间把握的不是很好，希望下次能够更 加细心，把握好时间。 感谢盛老师在实验过程中的耐心指导，感谢周围同学在实验过程 中的帮助，谢谢大家。