腋臭患者ApoD表达变化及其分子机制探究

腋臭患者ApoD表达变化及其分子机制探究 ［摘要］目的观察与E-3M2H分泌相关的载脂蛋白DApoD 和雄激素受体AR在腋臭患者的大汗腺的表达与正常人的差 异，探讨导致腋臭患者ApoD表达异常的原因。方法收集4 例正常对照和10例腋臭患者的组织样本，采用免疫组化、 realtime-PCR和western-blot检测腋臭患者组织中ApoD、 AR的表达水平，通过细胞培养和激素诱导，分析AR信号调 控ApoD表达的可能性，并阐明JNK1信号通路在其中扮演的 作用。结果实验发现ApoD和AR在腋臭患者的大汗腺的表 达与正常人有明显的差异，腋臭患者中ApoD表达几乎是正 常人的2倍；而腋臭患者中AR表达也明显增加，与此同时, 腋臭患者中JNK1活化增强。雄激素可以增强正常人ApoD的 表达，且该过程中同样伴有JNK1活化；抑制JNK1活化，可 以降低腋臭患者和雄激素诱导的ApoD的表达。结论ApoD 表达增加是腋臭患者的重要分子特征，其表达增加与AR信 号增强密切相关。JNK1的活化是腋臭患者和雄激素导致的 ApoD表达增加的重要原因，抑制JNK1活化，可以抑制腋臭 患者内源和雄激素诱导的ApoD的表达。 ［关键词］腋臭；载脂蛋白D ApoD； JNK；表达调控 ［中图分类号1R758. 74 ［文献标识码］A ［文章编 号11008-6455 2012 11-1956-05 腋臭是整形美容外科的常见病，给患者带来很大的精神 和心理压力，影响正常的生活和工作。目前治疗腋臭的方法 很多，治疗效果多不相同，具有一定的创伤和并发症。进一 步阐明腋臭发生的分子机制，在深入认识腋臭发生病理机制 的同时，有望发现无创治疗腋臭的新手段，对腋臭治疗具有 重要的意义。研究表明，（E） -3-甲基-2-已烯酸（E-3M2H） 的分泌在腋臭发生过程中具有重要作用，而载脂蛋白D （ApoD）是调控其分泌的重要分子。然而，腋臭患者中ApoD 的表达情况及其与腋臭的关系尚不清楚。深入分析腋臭患者 中ApoD的表达及其机制，对于认识腋臭的发生具有重要的 意义。本研究将集中探讨腋臭患者AR和ApoD的表达变化及 其相关性;分析AR信号是否可能调节大汗腺中ApoD的表达, 特别是JNK1信号在其中扮演的可能角色。 1材料和方法 1. 1临床样本收集收集2009年10月到2010年5月 在第四军医大学唐都医院整形激光美容中心手术治疗腋臭 的男性患者腋下组织标本10例，同时募集4例男性志愿者 （瘢痕修复患者或其他原因）。术中取患者左右两侧腋下新 鲜皮肤组织约6cmX0. 3cmX0. 3cm （深及脂肪层）。 1. 2细胞培养取自患者和志愿者的腋窝处皮肤经 D-Hanks液冲洗后，剔除脂肪组织。用眼科手术剪将皮肤剪 成lmm3的小组织块。然后用II型胶原酶孵箱中消化1天。 1天后，镜下获取汗腺组织，移入新的培养瓶中培养，加入 少许培养基，待汗腺组织块贴壁后继续加入2nd培养基继续 培养。每2〜3天换液一次。通常汗腺上皮中混有成纤维细 胞，而后者与汗腺上皮相比，贴壁较差。为了纯化汗腺上 皮细胞，通过胰酶分步消化的方法获取汗腺上皮细胞。胰酶 消化后，首先脱落的是成纤维细胞，吸弃后，继续消化依然 贴壁的汗腺上皮，则能获取较为纯的汗腺上皮细胞。整个过 程中，细胞培养采用DMEM10 FBSo 1. 3细胞处理 1.3. 1 JNK抑制剂处理将上述培养的腋臭患者细胞铺 板于6孔板，隔夜培养，待细胞长至70后给予JNK抑制剂 处理，抑制剂浓度为10-6M,继续培养24h后，收集细胞用 于基因表达检测。 1.3.2 5 a -DHT处理将培养的正常人细胞铺板于6孔 板，隔夜培养，待细胞长至70后给予5 a -DHT处理，剂量 分别为10-7M和10-6M o此外，我们还在10-6M浓度的 5 a -DHT基础上联合添加JNK抑制剂处理，抑制剂浓度为 10-6M,继续培养24h后，收集细胞用于基因表达检测。 1. 4 Western Blot检测目的基因表达 1. 4. 1 收集蛋白样品Protein sample preparation 将处理完的细胞，PBS洗涤后，按每孔加入80ul的RIPA蛋 白裂解液，冰上孵育30mino收集完蛋白样品后，为确保每 个蛋白样品的上样量一致，采用Pierce公司的BCA蛋白定 量试剂盒测定每个蛋白样品的蛋白浓度。将适量浓缩的5X 的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加入收集的蛋白样品中。沸水 浴加热3〜5min,以充分变性蛋白，离心后取上清备用。 1. 4. 2.电泳Electrophoresis首先配制 SDS-PAGE 凝胶，制备好后，把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内。 为便于观察电泳和转膜效果、判断蛋白分子量大小，在边缘 加样孔中加入预染蛋白质分子量Markero 1. 4. 3转膜Transfer本实验中使用硝酸纤维素膜 NC膜进行转移。转移条件为电流为200mA,转膜时间 为120mino整个过程在冰浴中进行。根据预染蛋白质分子量 Marker,判断转膜的效果。 1. 4. 4封闭Blocking转膜完成后，即刻把蛋白膜 放到预先准备好的Western洗涤液TBST中，漂洗1〜2min, 洗去膜上的转膜液。吸尽洗涤液后，加入含有10的脱脂牛 奶的Western封闭液，放置于摇床上缓慢摇动，室温封闭 120mino 1. 4. 5 一抗孵育 Primary antibody incubation 按 照预染Marker的指示，将目的基因所在位置的条带剪下。 参照一抗的说明书，按照合适比例用TBST稀释一抗，达到 合适浓度。用微型台式真空泵吸尽封闭液，即刻加入稀释好 的一抗4C孵育过夜。 1. 4. 6 二抗孵育 Secondary antibody inucubation 参照二抗的说明书，按照合适比例，用TBST稀释辣根过氧 化物酶HRP标记的二抗。二抗时需要根据一抗进行选择。 例如一抗是小鼠来源的IgG,则二抗需要选择抗小鼠IgG的 二抗，比如用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgGo 1. 4. 7蛋白检测Detection of proteins采用碧云天的 BeyoECL Plus ECL类试剂检测蛋白。压片采用专用的压片暗 盒FFC58/FFC83进行。用显影定影试剂盒P0019/P0020 配制显影液和定影液，自行手工洗片。X光片选用柯达原装 的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片。 1. 5免疫组化检测目的基因表达 1. 5. 1配制试剂 1.5.2操作流程脱蜡和水化；高压热修复抗原；组织 切片染色；脱水、透明、封片、镜检、照相。 1.6荧光定量PCR检测目的基因表达 1.6. 1提取高质量的RNA因为Real-Time PCR对RNA 样品的质量要求较高，在实验过程中要防止RNA的降解，整 个过程在冰上完成。具体步骤略 1.6.2琼脂糖凝胶电泳RNA,分析提取RNA的质量配 制1的琼脂糖凝胶电泳凝胶；取各个RNA样品4ul