颈椎后纵韧带胶原、蛋白多糖、钙含量变化的研究

颈椎后纵韧带胶原、蛋白多糖、钙含量变化的研究 【摘要】［目的］通过定量测定颈椎后纵韧带总胶原、I型胶原、 II型胶原、蛋白多糖和钙含量改变，探讨颈椎后纵韧带在颈椎病发病 机理中的意义。［方法］收集脊髓型颈椎病下位颈椎后纵韧带15例作 试验组，同年龄段正常下位颈椎后纵韧带10例作对照，Weossner法 测定两组总胶原含量；酶联免疫吸附法测定I型、II型胶原含量；间 苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量；甲基百里香酚蓝比色法测定钙 含量；进行HE染色和Masson染色，对比观察后纵韧带的显微结构变 化特点。［结果］试验组总胶原、I型胶原和蛋白多糖含量低于对照 组；试验组II型胶原含量较对照组高；试验组I型/II型胶原比值低 于对照组；试验组钙含量较对照组高，组间对比均有统计学意义P 0. 05；病理结构显示试验组弹力纤维、胶原纤维肿胀，排列紊乱。 ［结论］颈椎病患者颈椎后纵韧带退变，总胶原、I型胶原、II型胶 原、蛋白多糖和钙代谢发生紊乱，颈椎后纵韧带分子水平的生物化学 变化与颈椎病发生发展有密切关系。 【关键词】颈椎病；后纵韧带；胶原；蛋白多糖；钙化 颈椎病是以颈椎间盘退变为主要病变基础，导致颈周围肌肉、 关节继发性改变和相邻椎体退变增生而直接压迫神经血管所诱发与 之相关的临床症状和体征的疾病。后纵韧带退变在颈椎病的发病因素 中，占重要地位（1、2）。大量的研究表明颈椎后纵韧带退变与基因、 环境等多种因素有关。目前国内外对椎间盘及黄韧带的生物化学水平 微量变化进行了大量的研究，但对颈椎后纵韧带胶原和蛋白多糖等物 质生物化学水平定量变化的相关研究鲜见（3）。 本实验通过定量测定实验组和对照组总胶原、I型胶原、II型 胶原、蛋白多糖和钙含量变化，同时对比观察两组显微病理变化，为 颈椎后纵韧带退变提供分子生物化学量化依据，并探讨颈椎后纵韧带 在颈椎病发病机理中的意义。 1材料和方法 1. 1病例选择 病例组选取本院2005年10月〜2006年5月收 治病人中的15例脊髓型颈椎病手术患者的C4、5或C5、6节段颈椎 后纵韧带，并会除明显骨化块部分，其中男9例，女6例；年龄47 岁〜63岁，平均年龄54岁，颈椎病均根据临床症状、体征及常规X 线、MRI检查明确诊断；对照组由东南大学解剖教研室提供，为同年 龄段10例生前无糖尿病史、颈肩痛病史、家族性颈椎病史尸体，C4、 5和C5、6颈椎后纵韧带作对照，其中男6例，女4例；年龄45〜60 岁，平均52岁，在死亡后12h内取材。标本取得后，用生理盐水冲 洗，吸水纸吸干表面的水分，铝锡纸密封放入-80笔冰箱储存备用。 1.2主要试剂和仪器 标准羟脯氨酸Sigma,USA；酶标器Bio Red, USA； I型、II型胶原酶联免疫测定试剂盒TPI Inc, USA； 甲基百里香酚蓝比色法钙测定试剂盒南京建成生物技术有限公司， 中国；Masson三色试剂盒福建迈新生物技术开发公司，中国。 1. 3 Woessner方法测定羟脯氨酸标本脱水、脱脂、烘干、称 重，加100倍于样本量6 mol/L盐酸在110笆分解24 h,旋转蒸发 器会除盐酸，双蒸水溶解残留物，加氯胺T溶液室温静置20 min, 加过氯酸溶液室温静置5 min,加对苯胺基苯甲醛溶液在60笔温箱 20 min,取出待冷却，在波长560 nm处测定吸光值。通过羟脯氨酸 标准曲线计算出待测液内的羟脯氨酸浓度，以此推算组织总胶原蛋白 含量。 1.4 ELISA测定II型胶原的含量 标本称重，脱水脱脂，0.4niol 乙酸浸泡过夜，在冰浴下制备成匀浆，以盐析法提取胶原。酶联免疫 吸附法ELISA测定II型胶原，按试剂盒说明书的步骤进行，在波 长450 nm下测定II型胶原的浓度，计算含量。 1. 5蛋白多糖含量测定方法采用间苯三酚分光光度法4, 测定光密度值，转换为量值作蛋白多糖含量的测定。 1.6钙含量测定标本烘干称重，研磨成粉末，浓盐酸高温分 解，蒸发盐酸，双蒸水溶解残留物，按说明书进行甲基百里香酚蓝比 色法测定钙离子含量。 1.7组织病理学观察标本用10福尔马林浸泡过夜，脱水、 透明、浸蜡、切片，Masson染色，光镜观察。 1.8统计方法用SPSS 13. 0统计软件包对总胶原、I型胶原、 II型胶原、蛋白多糖和钙比值的数据进行分析，结果以x-土s表示， 组间差异比较应用两组均数的t检验。P0. 05表示差异有意义。 2结果 2.1标本大体观察试验组后纵韧带质地变硬，弹性减低，色 泽发白，有时可触及质地硬的骨化块。对照组后纵韧带质地柔软，富 有弹性，有光泽，湿润。 2.2 Woessner方法测定羟脯氨酸结果（表1） 表1羟脯氨酸和总胶原含量测定（略） 2.3 ELISA法测定I型、II型胶原含量及其比值（表2） 表2 I型和II型胶原含量测定（mg/g）及I型/II型胶原比值 （略） 2.4间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量和甲基百里香酚 蓝比色法测定钙离子含量（表3） 表3蛋白多糖和钙含量（略） 2. 5组织病理学观察Masson三色染色胶原纤维呈蓝色，弹性 纤维呈红色。实验组镜下出现较多的纤维变性区，弹性纤维减少，甚 至呈灶状缺失，胶原纤维增多，纤维肿胀，界限模糊，外形不规则， 细胞形态不规则，排列紊乱，细胞数较密（图1、2）o对照组光镜下 颈椎后纵韧带主要由胶原纤维和弹力纤维组成，纤维呈波浪状，排列 规则，与韧带纵轴一致。纤维间细胞稀疏，主要为纤维细胞，细胞成 梭形，长轴与纤维走向平行（图3、4）o 图1实验组HE染色（10X20）（略） 图2实验组Masson三色染色（10X40）（略） 图3对照组HE染色（10X20）（略） 图4对照组Masson三色染色（10X40）（略） 3讨论 3.1颈椎后纵韧带的病理变化后纵韧带以胶原纤维及弹性纤 维为主，胶原纤维使韧带组织具有一定的强度和刚度，胶原蛋白含量 多少、纤维走行，以及韧带的形状尺寸、截面积，与载荷方向一致的 纤维数目多少，纤维宽窄厚薄，决定后纵韧带的强度（5）。颈椎后纵 韧带承担着颈椎的张力载荷，有防止椎间盘后突出和限制脊柱过度前 曲的作用，对颈椎稳定性有重要作用（6）。随着年龄增加，椎间盘退 变，椎间隙变窄，椎间不稳，椎间异常活动增加，相应节段的后纵韧 带受到反复异常刺激。急慢性挫伤时后纵韧带发生出血、炎性水肿等 一系列病理变化，造成后纵韧带肿胀肥厚，反复微小出血，血肿机化, 甚至发展到软骨化或骨化，并成为压迫脊髓的因素之一。Ono等（7〕 通过病理研究显示颈椎病患者颈椎后纵韧带基质纤维性和非纤维性 组织增生。本组实验病理观察显示，与对照组相比较，病例组颈椎后 纵韧带明显发生退性变，其纤维之间的紧密联系丧失，纤维排列紊乱, 胶原纤维和弹性纤维网断裂，纤维间隙增宽，细胞形态不规则，呈玻 璃样变性，进一步证明颈椎病患者的颈椎后纵韧带退变。 3.2颈椎后纵韧带总胶原变化羟脯氨酸可作为半定 量测定总胶原的指标。和黄韧带、椎间盘等检测结果不同的是（8）, 本试验测得的结果显示，病例组总胶原较对照组减少。退变的颈椎间 盘内处于高压状态（9）,椎体不