浅析乳制品中三聚氰胺检测能力验证

浅析乳制品中三聚氤胺检测能力验证 摘要本文要以国家认监委组织的三聚氤胺能力验证为契机。以岛 津液相LC-10A配紫外检测器为例，以离子对试剂缓冲液/乙腊水溶液为流 动相，通过改变流动相的配比，从而调节该物质的最佳分离度，优化仪器 条件，来提高工作效率。并对乳制品样品的前处理方法进行探讨和改进. 关键词乳制品三聚氤胺检测高效液相色谱离子对试剂加标回 收率探讨 引言三鹿奶粉事件发生以来，三聚氤胺检测工作量急剧增加，检测 要求越来越高。为了验证检测实验室的检测技术能力，强化检测实验室监 督管理，国家认证认可监督管理委员会于2008年10月中旬开展了这次能 力验证活动。在此次能力验证活动中，阿克苏地区质量与计量检测所的“乳 品中三聚氤胺检测”能力验证项目获得“满意”结果，表明该所三聚氤胺 的检测能力符合国家有关要求，能够完全满足三聚氤胺检测的需要。就本 次能力验证采用高效液相色谱法做一些实验探讨。 三聚氤胺（化学式C3H6N6）呈弱碱性，能溶于甲醛、乙酸等，微溶 于水和醇，不可用于食品加工或食品添加物。三聚氤胺可用于生产食品包 装材料、农药和化肥，可能从环境、食品包装材料等途径进入到食品中， 在产品中检出微量属于正常。三聚氤胺的含氮量为66左右，常被不法商 人添加到食品中，以提升检测中蛋白质的含量指标。 一原理 试样用三氯乙酸溶液-乙腊提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后， 用高效液相色谱测定，外标法定量。 仪器与试剂 仪器 岛津高效液相色谱仪LC-10A,电子分析天平（感量为0.0001g）、 电子天平（感量为0.01g）、离心机、超声波清洗器、旋涡混合器、固相萃 取装置、氮吹仪、真空泵、50 mL具塞塑料离心管等。 试剂与材料试验用水均符合GB/T 6682-2008分析实验室用水规格 和试验方法一级水；甲醇、乙腊（色谱纯）；氨水、柠檬酸（优级纯）； 辛烷磺酸钠纯度大于98. 0； 50甲醇水溶液；1三氯乙酸溶液；5 氨化甲醇溶液；离子对试剂缓冲液准确称取2. 10 g柠檬酸和2. 16 g辛 烷磺酸钠，加入约980 mL水溶解，调节pH至3. 0后，定容至1L备用； 三聚氤胺标准品纯度大于99. 0； 1 mg/mL的三聚氤胺标准储备液（用 11甲醇-水溶液溶解定容）；阳离子交换固相萃取柱临用前依次用3 mL 甲醇和5 mL水活化；微孔滤膜0. 2um,有机相；氮气纯度大于99. 999 等。 二仪器工作条件 色谱柱C18柱，250 mmX 4. 6 mm, 5 u m （大连中汇达科学仪器有限 公司）;流动相离子对试剂缓冲液-乙腊（9010, V/V）；流速1.0mL/min； 柱温40C；波长240 nm ；进样量20 u L。 三分析方法 1. 标准曲线的绘制用流动相将三聚氤胺标准储备液逐级稀释得到的 浓度为 0.5、1、2、4、8、16 Ug/mL的标准工作液，以峰面积-浓度作图， 得到标准曲线回归方程。 2. 样品的测定 提取称取2 g （精确至0. 0001 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中， 加入15 mLl三氯乙酸溶液和5 mL乙腊，超声提取10 min,再振荡提取 10 min后，以4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤 纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL,移取5 mL滤液，加入5 mL水 混匀后做待净化液。 净化将上一步骤中的待净化液转移至固相萃取柱（Strata -X系列 SPE小柱，临用前已经活化）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至 近干后，用6 mL5的氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于40C下用氮气吹近干，用1 mL流动相定容，涡旋混合 1 min,过微孔滤膜后，供HPLC测定。 待测样液中三聚氤胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范 围则应稀释后再进样分析。 实验结果 1. LC-10A高效液相色谱仪所测三聚氤胺标准曲线结果。三聚氤胺标 准系列浓度为0.5、1、2、4、8、16 u g/mL ,三聚氤胺峰面积为36965, 74270, 148093, 292119, 583420, 1180109,相关系数 R0. 999959。 2、加标回收率试验。在不含三聚氤胺的奶样中分别加入浓度为2.0 和8. 0 u g/mL的三聚氤胺标准溶液，测得加标后的样品浓度和为1. 85和 7.80 u g/mL,三聚氤胺回收 率为92. 5和97. 5,得到了很好的回收率。 四、结果讨论 1. 离子对试剂缓冲液选择。离子对试剂选择庚烷磺酸钠要优于辛烷 磺酸钠。一般来说，碳链短的比碳链长的分离度要好，而且碳链越长，离 子对试剂和柱子的平衡时间越长，柱子越不易冲洗，对柱子损害越大。 2. 离子对试剂缓冲液pH值的选择。C18柱使用的缓冲液pH值范围在 29.5之间，太高的pH值，会使色谱柱硅胶溶解，太低的pH值，会使色 谱柱键合的烷基脱落。所以离子对试剂缓冲液pH值选择3.0 o 3. 流动相比例的选择。流动相（离子对试剂缓冲液和乙腊）的比例 应根据仪器和选择的色谱柱作相应的调整，以达到最好的色谱分离。原则 是尽量延长三聚氤胺的出峰时间，以便更好地分离杂质和目标物。乙睛含 量一般控制在10左右，乙腊比例越大，出峰时间越快。 注意事项。 1、样品为奶粉，在称取样品后，用三氯乙酸溶液将奶粉彻底溶开后 再加入5mL乙腊，混匀后再通过超声提取蛋白质。为提取彻底，可以适当 延长超声提取的时间。 2、离心机转速最好不低于8000 r/min,否则离心效果差，影响过滤 效果。 3、固相萃取柱在临净化前，一定要先活化，过柱时不能等流干之后 再加溶剂，防止气泡进入，影响净化和萃取效果；控制整个萃取过程流速 稳定且不得超过ImL/min 一般控制在25滴/分，否则影响去除杂质和洗 脱三聚氤胺的效果。 4、仪器的平衡因为流动相中添加了一定量的离子对试剂，大概需 要3h5h仪器才能达到稳定的状态。 5、分离选择合适的流动相比例，原则是尽量延长三聚氤胺的出峰 时间，以便更好地分离杂质和目标物。 6、当检出阳性样品的峰不规则时，应认真判断是否是杂峰或是与杂 峰重叠和污染。方法是从样品瓶中转移出一部分样液，加标后再进针判断, 或与有质谱的实验室进行比对。 参考文献 ［1］中华人民共和国国家标准，原料乳与乳制品中三聚氤胺检测方法 GB/T 22388-2008,北京中国标准出版社，2008 ［2］张晓彤，云自厚。液相色谱检测方法［M］北京化学工业出版 社 2000 ［3］于世林。高效液相色谱方法及应用［M］北京化学工业出版社 2000 ［4］中华人民共和国国家标准，分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 6682-2008,北京中国标准出版社，2008