HER2在结直肠癌中的表达及意义

HER2在结直肠癌中的表达及意义 作者张凯王中义李春生李红刘铜军 【摘要】 目的研究HER2在结直肠癌的表达及意义。方法应 用pathway array analysis方法分析了 56例结直肠癌肿瘤组织及癌 旁正常组织中HER2的表达。结果在56例结直肠癌患者中共发现HER2 阳性表达35例，21例正常黏膜组织中HER2过表达，其中16例结直 肠癌患者有淋巴结转移。结论HER2的表达与结直肠癌的发生发展相 关，检测HER2的表达可作为判断结直肠癌的生物学行为和预后的重 要指标。 【关键词】 结直肠癌；HER2; pathway array 国内外研究表明，ErbB2及表皮生长因子受体与多种肿瘤相关 〔1〕。已发现在人类肿瘤的改变包括基因扩增导致受体表达、激活激 酶域突变主要集中在表皮生长因子受体，并且ErbB2在表皮生长因子 受体的胞外域〔2〜4］在基因框架中缺失，每一种改变都可以导致 受体的持续激活从而促进癌症的发展。针对HER2的单克隆抗体及小 分子抑制剂（贺赛汀）已经在乳腺癌及非小细胞肺癌等的治疗中广泛 应用，但是在结直肠的应用鲜有报道。本实验采用pathway array analysis方法研究HER2及其信号通路在结直肠癌组织及癌旁正常黏 膜组织中的表达，探讨HER2表达变化与结直肠癌发生、病理类型及 预后的关系。 1材料与方法 1. 1材料 1. 1. 1标本来源 收集手术切除结直肠癌标本56例，其中高分化腺癌16例，中 分化腺癌21例，低分化腺癌12例，黏液腺癌7例。同时取这些病例 标本癌旁正常黏膜组织作为对照。所有标本在取材后20 min内迅速 置于干冰上，而后再转入-70C冰箱中进行低温保存。 1. 1. 2抗体 106种抗体均购于 Signa及 Ce 11 signa 1公司。p EKS Ser657/p KJR Tyrl068, p HER2rbB2 Tyrl22V4222/p HK1 er241 , p 询以彳 n Thr6341/pp53 Ser392, p KT er473/p PIEN er380, p RB er78Q/p Survivin, p beta catenin 6er35/7/Thr414 stat5 Tyr694 , p Stat3 Ser727 ERK , Thr202/Tyr204p42 p Kit Tyr712/p KJR Tyrll4S, p p70 S6 Kinase Jhr389/ VB3FR Receptor 2 Tyr951 p R5R Tyr65V654/p eIF4B er422, p HZF R c MET V12341235/p Suad 6er46次65 p ERK5 Ihr2ia/ryr220/p p90RSC er380 , p HT M MET Cfl003/p CREB erl33, p nTor er2448/p IKB Ihr505 , p IKB er32/p IGF 1 R / Insulin R Tyrll3]/Tyrll4, p cdc2 Tyrl5 c Jun er73, p Rb er807/811/p SARJNC 0hrl8Myrl83 , p FET3 Tyr 591Qp38 Thrl8Q/Iyrl82, Proteinmarker Qnvitroge小IgG 25ng cycl in Bl/cycl in DI, Cdk5/cdc25B, cycl in 5/cdk2 , p2WCAl, Cdkfeu, 1433 BetaAlKic EKQKFR, WelXdc25Q Hsp9Q/GKl, MWcdc2 p34, E2Fc myo/FCFR 3 0 Notch 1/beta catenin, AktzTrap, X lAI/Bcl 2, ETSWIF la , HIF 2a /TTF 1, p5Motch4 G5C5 PTEL/SRC 1, p30Q/c kit, BaX小 cadherin, raf cdc42/Ei f4b, p actiq/beta tubulTNF a /Vimentin, CR/Survivin, Ecadherii/IGF p , plg27, WTlfesothel in, Cleaved Caspase 3/GJX 2, EE/AIFI, p2/FkB52, NFkB5Kalretinin, VB3Wpl4, H RaBcl 6, K Ras/alpha tubul in , NFkBp65/4f 1. 2方法 1. 2. 1组织标本总蛋白提取、定量 1结直肠癌组织标本从液氮中取出后，迅速放置于锡箔纸 包被的干冰上，使其保持低温状态防止蛋白的降解。利用取材管穿取 约3 mix 3 mix 5 ran大小的组织块，加入1ml蛋白裂解液于冰上用 匀浆器研磨1 min,裂解10 mi a 2组织匀浆液转移至EP管。于 超声水浴器中超声震荡3次，每次15 然后将样品置入4C离心机 RCE 14 000顷⑴离心30 min;取上清即为提取总蛋白；3 蛋白定量采用心法测定，样品放入37C孵育30 min; 4取出样 品用分光光度仪在560 nm测定蛋白浓度，每个样品浓度取平均值。 5然后将其浓度都稀释至2. 5r庭1,加入体积4X缓冲液， 煮沸5min,置于-70C冰箱保存。 1. 2. 2 pathway array analysis 1取出样品解冻后，煮沸10 min,吸取186. 7 r 1,加入已 制备好的1阴SD6 呼港胶顶层的合成胶，均匀横铺整个合成胶。 2电泳横压100 Y电泳直到漠酚蓝到达分离胶底部。3转膜 卸下分离胶，将硝化纤维素膜Bio Rad、电转专用滤纸和海绵在 电转缓冲液中浸泡平衡。电转时，从负极到正极依次是海绵 滤纸 胶 硝化纤维素膜 滤纸 海绵，分别排除气泡，加入电转缓冲 液，接通电源，恒压100 V 2 h 4封闭电转结束后，取出硝化 纤维素膜，灰脱脂奶粉室温封闭40 min 5杂交将膜置于免疫 印迹杂交盒内 砸stern blotting mani fold Bio Racj,共 20条 杂交道，每条杂交道可以加1 〜2种抗体；5兑脂奶粉/IBS K 12. 5 ml 5 mol氯化钠溶液，12. 5 ml 1 mol Tris盐酸，pH7. 5, 1 ml 吐 温20,用水加至1 000ml稀释相应抗鼠或抗兔的一抗，与硝化 纤维素膜4C孵育过夜。 IBS洗涤3X 3 min, IBST洗涤2X 3 min; 5㈱脂奶粉/IBST稀释相应的二抗，与硝化纤维素膜室温孵育1 h, 从免疫印迹杂交盒中取下硝化纤维素膜，IBST洗涤3X 8min, IBS洗 涤