R-(-)-扁桃酸的生物合成研究进展

R---扁桃酸的生物合成研究进展 扁桃酸又名a-羟基苯乙酸，是极其重要的手性药物中间体，具有消炎和杀菌的双重作用。 目前国际市场上扁桃酸需求约以年均10左右速度增长，尤其是R---扁桃酸早已成为国内 外急需的产品R---扁桃酸及其衍生物是合成环扁桃酯、羟革哩、匹莫林等血管扩张剂、 杀菌剂、镇痉剂的重要药物中间体,且具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学 拆分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如治咳 药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由R型扁桃酸拆分。 目前制备扁桃酸旋光性单体的方法大致有囱①物理化学法，其中包括不对称合成法、 光学异构体拆分法和层析法等，不对称合成法可直接化学合成扁桃酸的异构体，拆分法先合 成外消旋体扁桃酸，再拆分获得手性扁桃酸；②生物合成法，，国外文献报道制备手性扁桃 酸大致有3种方法［］1以苯甲醛和氢氤酸为原料，先制得扁桃腊，后在腊水解酶的作用下, 得到R一一一扁桃酸。2先合成扁桃酸外消旋体，而后酯化或氨解获得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺, 再在酯化水解酶或酰胺水解酶的作用下，得到单一对映体扁桃酸。3以苯乙酮酸为底物直 接利用具有氧化还原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，多数是形成R---扁桃酸，而s--扁 桃酸则很少得到。其中，生物催化的手性合成反应具有条件温和、效率高、高度化学选择性、 区域选择性以及对映体选择性等优点，且生物催化过程无毒、无污染、能耗低，是一种环境 友好型合成方法，因而得到广泛的应用。总结国内外文献报道发现，主要可通过3种酶催化 途径制备R-扁桃酸①依赖于氧化还原酶体系催化合成R-扁桃酸；②以扁桃酸甲乙酯作为 原料，利用脂肪酶合成R-扁桃酸；③以外消旋的扁桃腊为底物，在腊水解酶的作用下，得到 单一对映体扁桃酸。 1氧化还原酶催化合成R-扁桃酸 1.1以外消旋的扁桃酸为底物 氧化还原酶生物催化法以外消旋扁桃酸为原料，在脱氢酶的作用下选择性氧化S-扁桃酸 为苯乙酮酸，苯乙酮酸在不对称还原酶的作用下被转化为R-扁桃酸，在此过程中，原混旋体 中的R-扁桃酸保持不变，如图1所示。 图1选择桂策化外消旋扃桃酸中的S-扁桃酸来生物转化为R-扁桃成 Ganapati等闵首先将外消旋体扁桃酸用交换树脂催化转变为扁桃酸甲酯，而后用假丝酵 母中的水解酶立体水解成R---扁桃酸，光学纯度达78。并且建立了一个双-双酶水解动力 学模型。Tsuchiya等同对败血性支气管产碱杆菌中的脱氢酶和粪链球菌中依赖于NADH的不 对称还原酶这两种酶体系结合使用，将外消旋的扁桃酸生物转化成单一异构体的R型产物， 其产量大于75, R-扁桃酸的e.e值大于99。另外，已报道可用于此类转化的菌种有多色 假单胞菌Pseudomonas polycolor和藤仓赤霉菌Gibberella fujikuroi等四。 1.2以苯乙酮酸为底物 苯乙酮酸已经是一种广泛使用、廉价的化工原料，对其直接进行不对称还原，获得高光学纯度的R-扁桃酸，将减少一步酶促反应口］。TakaoM等〔成利用链球菌、假丝酵母、肠球菌、 红酵母、酵母等中的还原酶将苯乙酮酸立体还原为R---扁桃酸，光学纯度为100。国内郭 黛苹，许小平等a】通过对38株菌进行初筛，获得对底物苯乙酮酸具有较高转化活性的出发 菌株假丝酵母Ca.3。进一步紫外与微波诱变，得到具有高转化率与高对映体选择性的突变菌 株Ca.3.37.48o在转化培养中，选择初始底物浓度30mmol/L、pH 7.0、温度32C的条件，R--- 扁桃酸得率86.5,对映体过量值为99.5。肖美添等［13］以苯乙酮酸为原料，利用酵母细胞 中的氧化还原脱氢酶，合成了R---扁桃酸，构型对映体过量值为95.1 。李忠琴等〔I以苯 乙酮酸为底物，从10株不同种类的菌株中筛选出具有不对称合成R-扁桃酸S.cl活性的酵母 菌，以此菌为出发菌株，进一步采用紫外和微波复合诱变技术，分别筛选获得突变菌 S.C1-MA16和S.cl-MEIO,构型对映体过量值达99.8。黄雅燕等〔成考察了酵母菌株FDllb不 对称还原苯乙酮酸生产R-扁桃酸的重复使用性能。在持续6批次的还原反应中，一直保持着 较高的催化还原活性，且e.e值均高于96.5,在30L发酵罐上进行分批放大试验时，还原反 应49h,产物收率为96.1 , e.e值为98.5。 1.3以外消旋苯基-1, 2-乙二醇为底物 Oda等SI利用微生物副百日咳博德特菌中的脱氢酶氧化外消旋的苯基一 1, 2-乙二醇合成 光学活性的扁桃酸如图2所示。在5. 09/L苯基-1, 2-乙二醇中，菌体可以积累产生2. 09/L R-扁桃酸，e.e值达到95。 OH OH OH 是扃桃St 图2苯基-1,2-乙二醇转化合成R-扁桃酸 2脂肪酶生物催化合成R-扁桃酸 脂肪酶法以混旋扁桃酸甲乙酯为底物，利用脂肪酶优先与R-扁桃酸甲乙酯反应生成 R-扁桃酸这一特点，以控制在反应初期生产具有较高e.e值的R-扁桃酸，如图3所示。 COOCHtCH, HiO ch,ch2oh E 3扁桃酸乙酯转化生成岳扃桃酸 高炳学,林金萍等］采用实验室筛选到的酿酒酵母LH1催化苯甲酰甲酸甲酯不对称合成 R---扁桃酸甲酯。Ganapati等同首先将外消旋体扁桃酸用交换树脂催化转变为扁桃酸甲酯， 而后用假丝酵母中的水解酶立体水解成R---扁桃酸，光学纯度达78。Yadav等U8］对脂肪 酶在非水相介质中催化水解外消旋扁桃酸甲酯制备R-扁桃酸进行了研究。用离子交换树脂 IRA 400作为催化剂通过酯化作用将外消旋的扁桃酸与甲醇混合制备外消旋的扁桃酸甲酯， 再分离得到R-扁桃酸。用Novozym 435脂肪酶特异性水解24h后，光学纯度达78,转化率 为19。Wei等四利用微生物伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp. GXU56脂肪酶选择性地将R,s-扁桃酸甲酯转化成R-扁桃酸。Palomo等企。】用乙二胺对固定化的脂肪酶进行修饰，大大地 改变了其活性、特异性以及立体选择性，用CNBr-CAL-B对脂肪酶进行化学修饰，R-扁桃酸 的转化率为50, e.e值大于99。高静等囚］在非水体系中用脂肪酶N435作为催化剂水解扁 桃酸乙酯外消旋混合物。R-扁桃酸乙酯的转化率为41.6, e.e 84.0。 3水解酶生物催化合成R-扁桃酸 腊水解酶是一类可以将腊转化成相应酸及氨基的酶。当以扁桃腊为底物时，脂肪族水解 酶立体选择性地生成R型扁桃酸，最重要的是其理论动力学反应产物收率为100。具体作 用机制如图4所示。 苯甲醛 图4分消旋扁桃睛转化生成R-腐械酸 Endo等㈣将消旋体扁桃腊与Rhodococcus微生物反应，酶催化水解扁桃腊得到R---扁桃 酸，R---扁桃酸的光学纯度达100。Cesar等〔23］采用来自木薯的有选择性的S-氧腊酶和来 自荧光假单胞菌EBC191的无选择性的腊水解酶，分两步转化苯